醫(yī)用臭氧對宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移抑制作用的初步研究

李錦程，唐水英，曾 濤，何曉峰

子宮頸癌嚴(yán)重影響女性健康，目前治療手段包括手術(shù)和放化療，存在易復(fù)發(fā)和5年生存率較低問題，需要尋求新的治療手段［1］。臭氧應(yīng)用于治療感染、腫瘤輔助治療以及介入手術(shù)已取得良好療效［2-3］。有研究報道臭氧療法在兔VX2腫瘤模型中取得一定療效［4-5］。臭氧通過誘導(dǎo)可控性氧化應(yīng)激刺激人體適應(yīng)性抗氧化反應(yīng)，但不會導(dǎo)致抗氧化劑顯著增加。在適當(dāng)濃度下，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化機(jī)制通常受到削弱［6］。有研究推測臭氧抗癌作用涉及活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生，ROS積累可抑制核因子（NF）-κB激活，而NF-κB在細(xì)胞增殖中起著關(guān)鍵作用［7-8］。同時有研究表明，NF-κB信號通路可能是臭氧作用的主要機(jī)制之一，包括刺激內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)上調(diào)、激活免疫功能和抑制炎癥過程［9］。目前臭氧已嘗試應(yīng)用于介入治療輸卵管炎癥及輸卵管梗阻［10-11］。本研究探討醫(yī)用臭氧對宮頸癌生長和遷移是否有抑制作用，分析ROS積累、NF-κB信號通路與細(xì)胞遷移間的關(guān)系，為臭氧介入治療宮頸癌提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人宮頸癌Hela細(xì)胞（中國科學(xué)院細(xì)胞庫），Dulbecco極限必需培養(yǎng)基（DMEM）（高糖）、胰酶、胎牛血清（美國Gibco公司），細(xì)胞計數(shù)試劑盒（CCK）-8（廣州貴靈生物科技公司），N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）、ROS檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司），NF-κB、上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)蛋白抗體（美國CST公司），結(jié)晶紫染色液（廣州杰特偉生物科技公司），醫(yī)用臭氧發(fā)生器（淄博前沿醫(yī)療器械公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

Hela細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM中。研究分別設(shè)空白組、NAC處理組、NAC和臭氧共處理組、臭氧組，其中臭氧濃度為半最大效應(yīng)濃度（concentration for 50%of maximal effect，EC50），由CCK-8檢測結(jié)果所求得。將細(xì)胞消化計數(shù)成100 W/mL細(xì)胞懸液，取5 mL裝入20 mL注射器中，空白組細(xì)胞不做任何處理，NAC處理組細(xì)胞加入5%體積60 mmol/mL NAC溶液預(yù)處理20 min，NAC和臭氧共處理組是在NAC預(yù)處理基礎(chǔ)上加入等體積臭氧氣體顛倒混勻15 min，臭氧組不加NAC，臭氧處理如上。

1.3 CCK-8檢測細(xì)胞活力

分別用0、5、10、20、30 mg/mL臭氧處理細(xì)胞后，將2×103細(xì)胞分別種植于96孔板，培養(yǎng)至24 h、36 h、48 h等3個檢測時間點(diǎn)后棄去舊培養(yǎng)基，每孔加入100μL CCK-8工作液，于孵箱孵育2 h后用酶標(biāo)儀在450 nm波長條件下檢測吸光度。根據(jù)前一步實(shí)驗(yàn)得到EC50值和培養(yǎng)時間，由上述分組再進(jìn)行檢測。

1.4 細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)

4組細(xì)胞處理完后，按照500/孔的密度將細(xì)胞接種于6孔板中，隨后置于孵箱培育，持續(xù)培養(yǎng)2周。培養(yǎng)完畢棄去舊培養(yǎng)基，甲醇固定后用結(jié)晶紫染色液進(jìn)行染色攝影并計數(shù)。

1.5 ROS水平檢測

4組細(xì)胞處理完后按100 W/皿密度接種于中皿中，培養(yǎng)24 h后用二氯二乙酸酯（DCFH-DA）探針進(jìn)行裝載，流式細(xì)胞儀檢測ROS水平。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)

在60 mm培養(yǎng)皿背面用馬克筆劃3條直線，每皿加入200 W細(xì)胞，待其長滿。將培養(yǎng)基加入注射器中，按其預(yù)設(shè)4組：空白組（不做處理）、NAC處理組（加入培養(yǎng)體系8%體積NAC溶液預(yù)處理20 min）、NAC和臭氧共同處理組（NAC預(yù)處理基礎(chǔ)上加入等體積臭氧顛倒混勻15 min）、臭氧組（僅加入等體積臭氧氣體充分混合15 min）。將上述處理過的培養(yǎng)基加入長滿細(xì)胞的皿中培養(yǎng)15 min，用槍頭沿著畫的直線垂直方向進(jìn)行劃痕，棄去培養(yǎng)基并洗滌2次，加入無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。于0 h、12 h、24 h等3個觀察時間點(diǎn)進(jìn)行攝影記錄，隨后進(jìn)行劃痕愈合面積統(tǒng)計和分析。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)

4組細(xì)胞處理后，加入到小室的上室，細(xì)胞密度為5×104，體積為200μL，培養(yǎng)基中不含血清。下室添加600μL含30%胎牛血清培養(yǎng)基。孵育24 h后用濕棉簽去除上室細(xì)胞。甲醇固定移行細(xì)胞后，結(jié)晶紫溶液染色攝影并計數(shù)。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測NF-κB和EMT相關(guān)蛋白

4組細(xì)胞處理并培養(yǎng)24 h后進(jìn)行裂解收集，紫光分光光度計測定蛋白濃度。每組添加100μg蛋白量上樣，12%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，200 mA恒流用聚偏二氟乙烯（PVDF）膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，10%牛血清白蛋白（BSA）進(jìn)行封閉，1∶1 000一抗?jié)舛?℃孵育過夜，次日用Tris緩沖0.9%NaCl溶液（TBST）洗膜3次，1∶5 000二抗?jié)舛仁覝胤跤? h后，再次TBST洗膜3次，電化學(xué)發(fā)光（ECL）顯影。以3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參對照。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

每次實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。采用GraphPad Prism 7.0版軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以±s表示。多組間比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臭氧處理抑制Hela細(xì)胞增殖

CCK-8法檢測Hela細(xì)胞增殖情況見圖1①，臭氧濃度5、10、20、30 mg/mL對Hela細(xì)胞增殖均有明顯的抑制作用，具時間和濃度依賴性，求得24 h時EC50為10 mg/mL，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均以10 mg/mL濃度培養(yǎng)24 h方案；NAC抵消臭氧誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞增殖抑制作用（圖1②）。細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)表明，臭氧處理可明顯減少Hela細(xì)胞集落數(shù)，同樣NAC可對抗一定的臭氧作用（圖1③）。

圖1 臭氧處理對Hela細(xì)胞增殖的影響

2.2 臭氧引起Hela細(xì)胞內(nèi)ROS升高

臭氧處理后，Hela細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高，而NAC預(yù)處理后ROS水平與空白組和NAC處理組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2。

圖2 臭氧處理對Hela細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

2.3 臭氧抑制Hela細(xì)胞遷移

劃痕實(shí)驗(yàn)分析顯示，臭氧處理后Hela細(xì)胞的傷口愈合能力（代表遷移能力）均受到抑制，且在12 h、24 h時點(diǎn)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（圖3①②）；Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，臭氧抑制Hela細(xì)胞遷移能力與劃痕實(shí)驗(yàn)一致（圖3③④）。

圖3 臭氧處理對Hela細(xì)胞遷移的影響

2.4 臭氧抑制Hela細(xì)胞NF-κB信號通路表達(dá)

臭氧處理結(jié)果顯示，Hela細(xì)胞NF-κB和κB抑制性蛋白激酶（IKK）α表達(dá)及其磷酸化水平均降低，同時EMT相關(guān)波形蛋白（vimentin）和β-連環(huán)蛋白（catenin）表達(dá)水平降低，見圖4。此外，NAC預(yù)處理細(xì)胞可在一定程度防止臭氧誘導(dǎo)NF-κB信號通路蛋白和EMT相關(guān)蛋白vimentin和β-catenin表達(dá)降低。

圖4 臭氧對Hela細(xì)胞NF-κB信號通路和EMT相關(guān)蛋白的影響

3 討論

臭氧對部分癌細(xì)胞有抑制增殖效果的機(jī)制尚不明確。本研究顯示臭氧對宮頸癌Hela細(xì)胞氧化應(yīng)激發(fā)生了作用，導(dǎo)致ROS在細(xì)胞內(nèi)聚集，使細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號通路和EMT相關(guān)蛋白發(fā)生改變，表現(xiàn)為增殖和遷移受到抑制。

臭氧是臭氧發(fā)生器利用醫(yī)用純氧電離產(chǎn)生的臭氧-氧氣混合氣體［12］。臭氧在介入治療領(lǐng)域已取得廣泛應(yīng)用，如治療缺血性疾病、炎癥疾病和癌癥［10，13-14］。有研究報道臭氧可對膀胱癌［15］、腺癌［16］和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［17］有間接作用，能抑制其進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)臭氧處理后，Hela細(xì)胞內(nèi)ROS有明顯增加。ROS是氧活性形式，其過量產(chǎn)生可導(dǎo)致大分子氧化，引起DNA突變和細(xì)胞死亡［18］；ROS積累會抑制NF-κB表達(dá)［7］。研究結(jié)果顯示NF-κB信號通路在多種腫瘤如宮頸癌、肝癌、胃癌、胰腺癌等進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［19］；NF-κB激活與腫瘤細(xì)胞生存、增殖、血管生成、擴(kuò)張和轉(zhuǎn)移相關(guān)［20］；臭氧可能是潛在的NF-κB抑制劑［21］。因此，臭氧通過增加ROS產(chǎn)生增加氧化應(yīng)激抑制NF-κB表達(dá)，可能是一種潛在的治療策略。

EMT是各種癌癥進(jìn)展期一至關(guān)重要的事件，與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究證實(shí)多種實(shí)體腫瘤在發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的同時，常伴有腫瘤細(xì)胞EMT［22］。Vimentin是EMT中重要因子，屬間質(zhì)源性，在正常細(xì)胞中表達(dá)量低或不表達(dá)，而在許多上皮腫瘤中高表達(dá)，是間質(zhì)細(xì)胞遷徙的重要調(diào)節(jié)者，在肝癌、胃癌等惡性腫瘤中均能直接促進(jìn)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移，其表達(dá)量與腫瘤預(yù)后呈負(fù)相關(guān)［23-24］。β-catenin是一種多功能可溶性蛋白，介導(dǎo)體內(nèi)許多生物過程，包括細(xì)胞增殖、黏附、分化等，在正常組織和良性上皮腫瘤中維持低水平，而在惡性腫瘤中表達(dá)陽性率可達(dá)50%以上，其表達(dá)量與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)［25-26］。本研究顯示臭氧處理后vimentin和β-catenin表達(dá)降低，提示臭氧影響細(xì)胞增殖遷移可能與影響EMT相關(guān)蛋白有關(guān)。

綜上，醫(yī)用臭氧可能通過抑制NF-κB信號通路下調(diào)vimentin、β-catenin抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖和遷移，ROS在其中發(fā)揮重要作用，表明醫(yī)用臭氧有望成為宮頸癌新的輔助治療手段。