ADRB2基因調控區多態性與兒童哮喘易感性的相關性研究

蔡明軒 魏兵 廖世峨 付金月 劉亞軍 李令雪

（中國人民解放軍北部戰區總醫院，遼寧沈陽110016）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應性為特征的異質性疾病，也是兒童時期最常見的慢性氣道疾病之一［1］。哮喘的患病率呈逐年上升趨勢，我國兒童哮喘發病率從1990年的0.91%至2010年的3.02%［2-3］，近二十年間“翻了兩番”。2013年，一項國際研究發現6～7歲和13～14歲兒童哮喘的患病率已分別達到11.7%和14.1%［4］。哮喘已經成為全球范圍內嚴重的公共衛生問題之一，然而哮喘的發病機制尚未明確，目前認為哮喘是由基因與環境因素之間復雜的相互作用導致的多基因遺傳性疾病。越來越多的研究集中于哮喘的分子生物學和遺傳學上，預知基因單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）/單倍型與兒童哮喘易感性相關的研究成為熱點領域。

染色體5q31-q33是與哮喘有關的主要基因座之一，β2腎上腺素受體（β2-drenergic receptor，ADRB2）基因是一個由1 239個核苷酸組成的無內含子區，其位于5q31-q32的哮喘易感片段內［5］。該基因大部分功能性啟動子位于ATG起始密碼子上游549 bp片段內，該片段呈現多種遺傳多態性［6］。目前，對ADRB2基因SNP與哮喘的相關性研究多是位于編碼區多態性位點的研究，對ADRB2基因調控區SNP研究較少。單個多態性位點作為疾病遺傳學指標有一定的局限性，單倍型的分析比單個多態性位點更適合哮喘表型的相關研究，國內外有關ADRB2調控區單倍型與兒童哮喘表型的研究未見報道。我們擬研究中國東北地區漢族兒童ADRB2基因調控區rs11168070（-468C/G）、rs17108803（-839T/G）、rs2053044（-1023G/A）、rs12654778（-654G/A）、rs11959427（-367T/C）、rs2895795（-1429T/A）位點SNP/單倍型與兒童哮喘易感的關系，從而進一步探索兒童哮喘的發病機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究為前瞻性研究，選取2016年10月至2020年10月就診于本院的哮喘急性發作期患兒152例，去除信息填寫不詳者9例，共納入143例為哮喘組，均符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016年版）》的診斷標準［1］。入組年齡5～12歲，平均年齡（7.1±1.4）歲；女52例，男91例。根據哮喘急性發作嚴重度分為輕度組61例，中重度組82例。對照組兒童選取同期于我院兒童保健診室體檢的健康兒童137例，年齡5～12歲，平均年齡（7.2±1.6）歲；女54例，男83例。所有入組兒童均為東北地區漢族兒童，三代內無血緣關系，入組前4周無呼吸道感染史。哮喘組和對照組兒童年齡（t=0.781，P=0.435）和性別（χ2=0.277，P=0.599）差異均無統計學意義。本研究經本院倫理委員會批準［倫審Y（2020）054號］，所有患兒家屬均簽署知情同意書。

1.2 引物設計及合成

應用在線Primer3軟件設計引物，延伸引物用于單堿基延伸，引物信息見表1。

表1 引物信息

1.3 DNA提取

收集兩組受檢兒童靜脈血2 mL于EDTA抗凝管，存于-80℃冰箱待檢。DNA提取采用TIANGEN公司血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）。

1.4 目的基因SNP分型

采用SNaPshot SNP技術，對ADRB2基因調控區6個位點進行等位基因的檢測，行三重PCR擴增，取0.5 μL純化后的延伸產物，與0.5 μL片段化分析標準品及9 μL高度去離子甲酰胺混勻，于95℃變性5 min后放置于ABI3730XL測序儀上進行測序，ADRB2基因調控區6個位點電泳峰型見圖1～6，箭頭所指即為基因型所在位置，單個箭頭為純合型，兩個箭頭為雜合型。

圖1 rs2053044位點電泳峰型圖 A為GG基因型；B為GA基因型；C為AA基因型。

圖2 rs2895795位點電泳峰型圖 A為AA基因型；B為TA基因型；C為TT基因型。

圖3 rs12654778位點電泳峰型 A為GG基因型；B為GA基因型；C為AA基因型。

圖4 rs11168070位點電泳峰型圖 A為CC基因型；B為CG基因型；C為GG基因型。

圖5 rs11959427位點電泳峰型圖 A為TT基因型；B為TC基因型；C為CC基因型。

圖6 rs17108803位點電泳峰型圖 A為TT基因型；B為GT基因型。

1.5 統計學分析

采用SPSS 24.0軟件進行統計學分析。計數資料采用例數和百分率（%）表示，率的比較采用卡方檢驗；應用二元logistic回歸分析ADRB2基因6個位點SNP/單倍型與哮喘相關性，P＜0.05為差異有統計學意義。連鎖不平衡及單倍型分析采用Haploview軟件。運用Hardy-Weinberg平衡檢驗以驗證入組樣本的群體代表性，P＞0.05為群體代表性好。

2 結果

2.1 兩組群體代表性

應用Hardy-Weinberg平衡檢驗檢測兩組rs11168070、rs17108803、rs2053044、rs12654778、rs11959427、rs2895795位點的基因型頻率，哮喘組P值分別為1.000、1.000、0.448、0.448、1.000、0.377，對 照 組P值 分 別 為1.000、0.192、0.826、1.000、1.000、1.000，兩組研究樣本符合Hardy-Weinberg平衡定律，提示群體代表性好。

2.2 ADRB2基因6個位點基因型及等位基因在哮喘組和對照組中的分布

rs2895795、rs2053044和rs12654778位點基因型及等位基因頻率在兩組兒童中的分布差異有統計學意義（均P＜0.05），rs11168070、rs17108803和rs11959427位點基因型及等位基因頻率在兩組兒童中差異無統計學意義（均P＞0.05）。進一步經二元logistic回歸分析顯示，rs2895795、rs2053044和rs12654778位點中攜帶A等位基因者患哮喘的風險OR分 別 為0.443（95%CI：0.259～0.756）、2.124（95%CI：1.232～3.661）和2.087（95%CI：1.260～3.457）（表2）。

表2 ADRB2基因調控區6個位點基因型及等位基因在兩組中的分布及logistic回歸分析［n（%）］

2.3 ADRB2基因調控區6個位點基因型與兒童哮喘嚴重程度的關系

6個位點基因型在哮喘輕度組和中重度組分布的分析顯示，rs2895795和rs11168070位點基因型在病情嚴重程度組間差異有統計學意義（P＜0.05）；rs2053044、rs12654778、rs17108803和rs11959427位點基因型在輕度組和中重度組間差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 ADRB2基因調控區6個位點基因型與兒童哮喘嚴重程度的關系［n（%）］

2.4 ADRB2基 因 調 控 區rs2895795、rs2053044、rs17108803、rs12654778、rs11168070、rs11959427組成的單倍型分布與兒童哮喘的關系

經Haploview軟件分析發現，哮喘組和對照組兒童ADRB2基因調控區6個位點間均存在連鎖不平衡，連鎖強度見圖7，共構成5種單倍型（表4），哮喘組中頻率最高的是TGTACT（42.7%）。單倍型TATGCT、TATGGC和AGTGCT的頻率在哮喘組和對照組分布差異有統計學意義（分別χ2=6.554、5.403、11.297，均P＜0.05）；通過二元logistic回歸分析結果顯示，其中單倍型TATGCT和TATGGC患哮喘的風險OR分別為1.792（95%CI：1.142～2.812，P＜0.05）和1.946（95%CI：1.102～3.438，P＜0.05）；單倍型AGTGCT患哮喘的風險OR為0.523（95%CI：0.357～0.765，P＜0.05）。

表4 ADRB2基因調控區6個位點單倍型與哮喘的logistic回歸分析［n（%）］

圖7 連鎖不平衡強度圖 白色小方框中數值為連鎖不平衡系數（D'）的百分數，數值越大表示連鎖性越強，沒有數值表示D'=1，代表完全連鎖不平衡。數字1、3、4、5、6、7代表位點在基因片段上所在位置順序。

2.5 ADRB2基因調控區6個位點單倍型在哮喘嚴重程度組中的分布

單倍型TATGCT和AGTGCT頻率在輕度組和中重度組間分布差異有統計學意義（分別χ2=6.075、4.858，均P＜0.05），其中單倍型TATGCT在中重度組分布頻率較輕度組高，為輕度組的1.885倍，差異有統計學意義（χ2=6.075，P＜0.05）；單倍型AGTGCT在輕度組分布頻率較中重度組高，為中重度組的1.671倍，差異有統計學意義（χ2=4.858，P＜0.05）；單倍型TATGGC、AGGGCT和TGTACT分布頻率在兩組間差異無統計學意義（P＞0.05），見表5。

表5 ADRB2基因調控區6個位點單倍型在哮喘不同嚴重程度中的分布［n（%）］

3 討論

哮喘是一種病因復雜具有異質性的慢性呼吸系統疾病，其發病機制被認為是全球性醫學領域的難點問題。伴隨研究的逐漸深入，大多數學者認為哮喘是由遺傳因素和環境因素長期相互作用所致，其中遺傳因素約占48%～79%［7-8］。Khan等［9］針對雙胎和有兄弟姐妹的家庭進行研究，結果顯示哮喘的遺傳方式不遵循孟德爾遺傳學定律，表現為家庭聚集的趨勢。ADRB2在肺組織、支氣管平滑肌細胞和支氣管上皮細胞中高度表達并調節肺功能，ADRB2基因SNP/單倍型可以改變ADRB2的功能［10-13］。ADRB2基因5’調控區內含開放性閱讀框架，編碼ADRB2基因上游啟動子區的一個多肽，已證明該區域有個常見的SNP，即-47位點上的C突變為T，導致編碼的第19位精氨酸變為半胱氨酸［14］。

本研究分析ADRB2基因調控區6個位點SNP與兒童哮喘易感性的關系，rs2895795位點檢測出TT、TA和AA 3種基因型，與Cai等［15］研究新疆哈薩克族和維吾爾族人群ADRB2調控區基因多態性結果一致，其中AA基因型在哮喘組中明顯低于對照組，提示rs2895795位點SNP與兒童哮喘易感相關，次等位基因A降低兒童患哮喘的風險，是兒童哮喘易感的保護性因素，我們推測可能由于次等位基因A參與了正向調節ADRB2基因啟動子活性，使ADRB2活性及表達增加。本研究rs2053044位點檢測出G和A兩種等位基因，次等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）在哮喘組和對照組兒童中有明顯差異，攜帶次等位基因A且為AA基因型時兒童患哮喘的風險增高，提示次等位基因A與兒童哮喘易感相關，是兒童哮喘的危險因素，與Skouen等［16］的研究結果相似，但de Souza Tesch等［17］對巴西人群ADRB2基因rs2053044位點SNP分析時未發現該位點SNP改變ADRB2基因的表達，考慮結論差異可能與地域因素有關。本研究中rs17108803位點只檢測出TT和GT兩種基因型，未檢測到GG基因型，TT和TG基因型頻率在哮喘組和對照組分布無差異，提示該位點SNP與兒童哮喘易感不相關。rs12654778位于ADRB2基因上游654 bp處，存在GG、GA和AA 3種基因型，MAF分布在哮喘組和對照組兒童中有顯著差異，與Li等［18］研究結論相似，本研究提示rs12654778位點SNP與兒童哮喘易感相關，攜帶次等位基因A且為AA基因型時兒童患哮喘的風險增高。rs11168070位點有CC、CG、GG 3種基因型，分析得出該位點SNP與兒童哮喘易感不相關，Sio等［19］研究316名亞洲人群中發現rs11168070位點G等位基因增強了ADRB2的表達，這與研究結果不一致，考慮可能與種族差異和樣本量大小有關。本研究rs11959427位點共檢測出TT、CT和CC 3種基因型，未發現該位點SNP與兒童哮喘易感相關。

本研究顯示rs2895795和rs11168070位點SNP在輕度組和中重度組有明顯差異，表明上述2個位點與哮喘病情嚴重程度相關。這與Ramphul等［20］關于毛里求斯、印度和中國3個不同地域的385名哮喘兒童ADRB2基因調控區SNP影響ADRB2啟動子的活性導致該基因差異性表達的研究結果相似。但不同的是，陳慧芬等［21］研究未發現ADRB2基因多態性位點與哮喘病情嚴重程度有關。一項基于歐洲人群的多中心縱向隊列研究通過隨訪604名哮喘患兒10年發現ADRB2基因SNP與哮喘病情嚴重程度有關［22］。本研究中rs11168070位點SNP與兒童哮喘易感不相關，進一步分析時發現該位點SNP與兒童哮喘病情程度相關，考慮該位點可能參與了某種未知的機制，從而改變了ADRB2基因的表達。本研究并未發現rs11959427、rs17108803、rs12654778和rs2053044位點SNP與哮喘病情程度有關。

連鎖不平衡又稱為等位基因關聯，是指同一條染色體上的兩個等位基因非隨機相關。目前對單倍型的研究較少，中國人群和其他種族人群之間與哮喘易感性有關的單倍型頻率存在差異［23-24］。一項針對墨西哥人群中421名哮喘兒童和430名健康兒童的病例對照研究發現ADRB2基因AGGACC、AGGAAG、TGAGAG、AGGAAC和AAGGAG單倍型與兒童時期哮喘易感性有關［25］。Liu等［26］基于中國漢族人群ADRB2基因研究得出單倍型CCGGC促進了哮喘發生的結論。Akparova等［27］在哈薩克族人群中分析ADRB2基因16和27多態性位點組成的單倍型時發現Arg16Gly/Gln27Gln和Arg16Gly/Gln27Glu單倍型在哈薩克族哮喘患者中更為常見。Chung等［28］針對2 979例白種人的病例對照研究顯示ADRB2基因上11個位點中有3個多態性位點存在連鎖不平衡，構成的單倍型ATA和AGG與哮喘易感性有關。Tian等［29］對298例哮喘兒童和304例健康兒童研究發現ADRB2基因47和79位點SNP構成的單倍型可能增加兒童哮喘的易感性。Shah等［30］研究112例南印度人群ADRB2基因SNP與哮喘的發生時發現GGCG單倍型致哮喘的發生增加了3.1倍，GGCG單倍型與哮喘風險增加有關。本研究對ADRB2基因調控區6個多態性位點構成的單倍型進行分析，發現單倍型TATGCT、TATGGC和AGTGCT與兒童哮喘易感相關，其中單倍型TATGCT是兒童哮喘的危險因素，且TATGCT者患中重度哮喘較多，單倍型AGTGCT是兒童哮喘的保護因素，進一步分析病情程度時發現攜帶AGTGCT單倍型者患哮喘的程度較輕，表明TATGCT和AGTGCT與哮喘嚴重程度相關。

ADRB2基因多態性廣泛存在于不同地域、不同種族人群中，其變異的復雜性和潛在性可能決定著哮喘的大量或部分表型，本研究發現ADRB2基因調控區SNP/單倍型與中國東北地區兒童哮喘易感性相關，其構成的單倍型TATGCT和TATGGC是兒童哮喘的危險因素，為探討中國哮喘遺傳機制提供了循證醫學依據。但本研究樣本量相對較小，需加大樣本量做進一步研究。此外，本研究僅檢測了ADRB2基因調控區的6個多態性位點，并未對其他位置多態性位點進行分析和完整單倍型的研究，其他位置可能存在某些具有功能性的多態性位點，多基因聯合研究對哮喘遺傳機制的揭示有重要的意義，或許可成為以后的研究方向。