米曲霉和黑曲霉協同發酵杏仁粕風味物質的變化

零春甜，湯輝煌，周彩瑩，楊 晨，汪建明

(天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457)

苦杏仁俗稱山杏仁，是世界上最流行的堅果之一[1].杏仁粕是杏仁油提取后的副產物，蛋白質含量豐富，占杏仁粕的50%以上.采用微生物發酵杏仁粕，不僅可以將蛋白質降解為多肽和氨基酸等物質，還可以產生具有杏仁粕曲料特征的風味.黑曲霉是一種廣泛運用于食品發酵的真菌，用來發酵杏仁粕不會產生真菌毒素，符合食品衛生的要求[2].米曲霉是一種生長快、酶系豐富、不產毒素的菌種，目前廣泛應用于調味品的生產[3].

近年來，利用微生物發酵改良食品風味已有較多報道.周彩瑩等[4]在最佳工藝條件下用黑曲霉發酵亞麻籽粕，測得氨基態氮含量為1.92%時產生風味的香氣濃郁.左勇等[5]研究發現發酵甜面醬的氨基態氮含量為13.78～16.6mg/g時，對鮮味有重要貢獻.任利平等[6]利用發酵酶解法優化干腌火腿風味基料氨基態氮含量為2.25%，風味評分最高.混菌發酵產生的酶系比單一菌種復雜，可顯著改良食品的風味和口感.

因此，本文采用黑曲霉、米曲霉協同發酵杏仁粕，以氨基態氮含量和特征風味強度為考察指標，通過感官評價和儀器測定的方法，研究影響杏仁粕發酵過程中風味物質的關鍵因素，使杏仁粕在微生物發酵下有效風味成分充分釋放，賦予杏仁粕豐滿的風味，為杏仁粕制曲產肉味香精基料提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

杏仁粕，張家口永昌源果仁食品有限公司；黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)菌粉，山東康源生物技術有限公司.

甲醛、三氯乙酸(TCA)，分析純，天津市津科精細化工研究所；石油醚，分析純，天津市津東天正精細化學試劑廠；硼酸，分析純，天津市大茂化學試劑廠.

DW-86L386型超低溫冰箱，青島海爾股份有限公司；TDZ5-WS型低速離心機，長沙湘儀離心機有限公司；自動凱氏定氮儀，山東海能科學儀器有限公司；HFU586BASIC型立式超低溫冰箱，德國Thermo Scientific公司；Evolution300型紫外可見分光光度計，Thermo Fisher Scientific 公司；LE438型pH電極，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Trace1300 ISQ型氣質聯用儀，蘇州冷杉精密儀器有限公司.

1.2 制曲方法

材料預處理：杏仁粕經過粉碎機粉碎，80目過篩，密封備用.

制曲流程：取粉碎、過篩后的杏仁粕10g裝入三角瓶，120℃高壓蒸汽滅菌30min，降溫取出迅速打散，待溫度降至室溫，根據杏仁粕的質量接種5%的混合菌粉(黑曲霉、米曲霉)，再加入適量水，混合均勻.30℃恒溫培養5d，當瓶內布滿菌絲且菌絲聯結基質成塊后翻曲，最后出曲.

1.3 測定方法

揮發物含量測定：參考GB/T 14489.1—2008《油料水分及揮發物含量測定》方法；氨基態氮的測定：采用甲醛滴定法，參考ZB X 66038—1987《氨基態氮測定法》.

曲料風味強度的評定：具體方法參照文獻[7]高溫大曲質量的評分，風味強度＝外觀＋皮厚＋斷面＋香氣.在前人研究方法的基礎上，選擇外觀、皮厚、斷面、香氣等感官評價標準，評分標準見表1.篩選14名經過培訓的小組成員(男7名，女7名，年齡23～48歲)進行描述性感官評價分析.

表1 曲料質量評分指標Tab. 1 Standards for evaluation of koji quality

頂空固相微萃取(HS-SPME)：準確稱取5g樣品于20mL的樣品瓶中，(60±0.5)℃水浴恒溫平衡15min，將三相萃取頭插入樣品瓶中頂空萃取40min后取出萃取頭，再插入GC-MS進樣口解析15min，檢測其揮發性組分.色譜條件：色譜柱為TR-5MS型石英毛細管柱(30m×0.32mm×0.25μm)；進樣口溫度250℃；初始溫度40℃，保持3min，以4℃/min升到150℃保持4min；載氣為高純氮氣，不分流模式，流量為1mL/min.質譜條件：連接口溫度250℃，EI離子源，電子能量70eV，離子源溫度300℃，質譜掃描范圍(m/z)50～300.

1.4 杏仁粕曲料風味的影響因素優化

1.4.1 單因素實驗

菌種比對曲料風味的影響：按照米曲霉與黑曲霉質量比(g﹕g)為1﹕0、0﹕1、2﹕1、3﹕1、4﹕1進行發酵，發酵溫度37℃，水料比(mL﹕g)為1﹕1.以氨基態氮含量和風味強度為指標確定適宜菌種比.

水料比對曲料風味的影響：在上述確定的適宜菌種比的基礎上，按照水料比(mL：g)為0.2﹕1、0.4﹕1、0.6﹕1、0.8﹕1、1.0﹕1進行發酵，發酵溫度37℃.以氨基態氮含量和風味強度為指標確定適宜水料比.

發酵溫度對曲料風味的影響：在上述確定的適宜菌種比和水料比的基礎上，按照25、30、35、40、45℃的發酵溫度進行發酵，以氨基態氮含量和風味強度為指標確定適宜發酵溫度.

1.4.2 響應面分析

以菌種比、水料比、發酵溫度3個因素的不同設定條件進行優化，測定曲料中的物質風味強度和氨基態氮含量.在單因素的實驗結果基礎上，根據Box-Benhnken的中心組合實驗設計，確定最佳工藝參數.

1.5 數據處理

單因素實驗數據使用Origin9軟件分析，Box-Benhnken的中心組合實驗采用Design-Expert 10.0.7統計軟件進行分析.所有實驗均經過3次平行實驗.

2 結果與分析

2.1 單因素實驗對曲料風味的影響

杏仁粕發酵過程菌種比、水料比、發酵溫度對曲料風味的影響如圖1所示，其中不同字母表示組間有顯著差異.

圖1 培曲菌種比、水料比、發酵溫度對氨基態氮含量和風味強度的影響Fig. 1 Effects of culture strains ratios，waters-material ratios and temperature on amino acid nitrogen and sensory properties

菌種比決定菌種在發酵過程中的生長繁殖速度，并直接決定發酵產物種類和含量[7].由圖1(a)可知：曲料中氨基態氮含量和風味強度在發酵過程中的變化趨勢相似，成曲的氨基態氮含量和風味強度隨著黑曲霉的增加而減少，表明成曲中酸性蛋白酶活力較少，中性蛋白酶活力較高.氨基態氮含量和風味強度隨米曲霉的增加而增加.在米曲霉和黑曲霉質量比為3﹕1時，氨基態氮含量和風味強度都達到最大值，表明中性蛋白酶活力較強[8].當米曲霉和黑曲霉質量比為4﹕1時，氨基態氮含量和風味強度都出現下降，可能是菌株分泌的酶下降導致.因此，初步確定米曲霉和黑曲霉的適宜質量比為3﹕1.

曲料水分與氨基態氮含量有重要關系.水分過多時，不利于各種酶類的代謝反應，造成曲料過稀，對于酶活力有一定的影響.由圖1(b)可知：不同的水料比對氨基態氮的含量有影響，隨著水分的增加，曲料中的氨基態氮含量呈現先增加后減小的趨勢.水料比(mL﹕g)為0.2﹕1～0.4﹕1時，由于水分含量適宜，適合蛋白酶活性，將蛋白質分解成游離氨基酸，使氨基態氮含量增加，風味強度也隨之逐漸增加[9].水料比為0.4﹕1時，曲料中的氨基態氮含量最高為1.197%，水料比超過0.4﹕1時，由于水分活度大，對蛋白酶起到抑制作用，蛋白酶分解蛋白的能力降低，使得曲料中氨基態氮含量逐漸減少.當水料比超過0.6﹕1時，曲料中氨基態氮含量和風味強度均隨著水分的增加而下降，原因是微生物的生長需要適宜的水分，過多或過少的水分均會影響其生長繁殖，對其發酵產物產生影響[10]，水分的稀釋作用也會對滋味和香氣造成不利影響[11].因此，初步確定水料比的適宜比例(mL﹕g)為0.4﹕1.

發酵溫度通過改變微生物的蛋白質、核酸的結構和活性進而影響微生物的代謝產物的生成種類和生長情況[12].由圖1(c)可知：在制曲過程中，氨基態氮含量隨著溫度呈現先上升后下降的趨勢.當培養溫度達到30℃時氨基態氮含量達到最高，并顯著高于其他組(P＜0.05)；從30℃升高到45℃的過程中，氨基態氮含量直線下降，這可能是由于溫度高于30℃抑制了菌種發酵過程中產生的酶活性[13].相反，風味強度隨著溫度的升高而逐漸升高，這可能是由于溫度越高，杏仁粕發生美拉德反應的產物越多，香氣越厚重，風味強度越高.當溫度高于40℃時，氨基態氮含量下降，不利于風味物質的產生，因此初步確定適宜發酵溫度為30℃.

2.2 響應面實驗結果

以米曲霉與黑曲霉質量比(A)、溫度(B)、水料比(C)為因素，曲料的氨基態氮含量(Y1)和風味強度(Y2)為響應值進行制曲優化實驗.響應面Box-Behnken實驗設計與結果見表2.氨基態氮含量響應面模型的方差分析結果見表3.

表2 Box-Behnken實驗設計與結果Tab. 2 Box-Behnken design and results

表3 氨基態氮含量的響應面方差分析Tab. 3 Analysis of variance of response surface of amino acid nitrogen

從表3中可以看出，模型的F值為19.79，P＞F小于0.05，說明總體該模型顯著.該模型失擬項的P＞F為0.86，大于0.05，失擬項不顯著，說明該模型選擇合適，可以用于氨基態氮含量變化的分析.

顯著影響因素對氨基態氮含量的交互作用如圖2所示.菌種比和溫度、溫度和水料比之間存在顯著的交互作用(P＜0.05)，與方差分析的結果一致.利用Design-Expert 10.0.7 分析軟件對數據進行擬合得到氨基態氮含量的二次回歸方程為

圖2 顯著影響因素對氨基態氮含量的交互作用Fig. 2 Interaction of significant influencing factors on amino nitrogen content

風味強度響應面模型方差分析結果見表4.

表4 風味強度的響應面方差分析Tab. 4 Analysis of variance for response surface of sensory properties

從表4中可以看出：模型的F值為15.56、“P＞F”小于0.05，說明總體該模型顯著.該模型失擬項的“P＞F”為0.85，大于0.05，失擬項不顯著，說明該模型選擇合適，可以用于風味強度變化的分析.

顯著影響因素對風味強度的交互作用如圖3所示.從圖3中可以看出，菌種比與溫度之間存在顯著的交互作用(P＜0.05)，與方差分析的結果一致.

圖3 顯著影響因素對風味強度的交互作用Fig. 3 Interaction of significant factors on flavor intensity

用Design-Expert 10.0.7分析軟件對數據進行擬合，得到風味強度的二次回歸方程為

Y2＝81.6－0.25A－3.38B＋9.63C－5.50AB＋1.50AC－0.75BC－5.18A2－5.93B2－2.43C2加權綜合評分(Y)算法參考文獻[14].本實驗中曲料的氨基態氮含量和風味強度對曲料的風味同樣重要，所以加權系數均定為0.5.

Y＝0.5Y1＋0.5Y2

即

Y＝41.35-0.06A-1.76B＋5.01C-2.83AB＋0.78AC-0.45BC-2.69A2-3.01B2-1.34C2

2.3 最佳工藝條件

綜合以上對氨基態氮含量和風味強度的響應面模型進行數學分析，以加權綜合評分最大化為指標，得到發酵的最優條件為米曲霉與黑曲霉質量比(g﹕g)0.375﹕0.125、溫度30℃、水料比(mL﹕g)為0.5﹕1.此條件下發酵5d成曲的加權綜合評分為43.10，氨基態氮含量為0.95%，風味強度為75.20.考慮到實際操作情況，將各條件修正為米曲霉與黑曲霉質量比(g﹕g)3﹕1、溫度30℃、水料比(mL﹕g)0.5﹕1.在此條件下進行3次平行實驗，氨基態氮含量為1.25%，風味強度為80.00，加權綜合評分為40.61，與預測值接近.這說明該模型很好地預測了曲料的氨基態氮含量和風味強度，優化工藝條件可靠.

2.4 揮發性風味物質分析

杏仁粕發酵前后鑒定香氣物質見表5.

共檢測了22種主要成分，其中酯類3種、醛類5種、醇類5種、酮類1種、酸類2種、酚類2種、含氮化合物3種、雜環化合物1種.曲料風味物質主要為苯甲醛、苯甲醇、3–辛酮、苯甲酸甲酯和苯甲酸乙酯，其中醛類和酮類是含羰基化合物，是肉香的特征物質.醇類化合物主要是脂質的氧化降解或者是羰基化合物還原生成，主要具有花香、甜香和水果香.酯類化合物可以通過醇和有機酸酯化反應生產，一般賦予食品花香和果香.雜環化合物具有焦香味，可以使食物呈現烤肉香味[15].發酵后的醇類和酯類酸類總量均高于發酵前的杏仁粕，這與文獻[16]研究結果一致，特別是發酵后總的醇類含量是未發酵的總醇類含量的6倍，是曲料產香的主體成分，也是形成酯類物質的前體，這使得曲料的風味大大增加[17].適量的酸也可以提高曲料的整體協調性[18].曲料生產的過程中，由于溫度升高，曲料中的蛋白質和微生物殘體自溶，轉化為氨基酸等物質產生曲香[19].風味物質的差異是造成原樣和曲料感官特征不同的主要原因.

3 結 語

以杏仁粕為制曲基質，對曲料中氨基態氮含量和風味強度的影響因素進行分析.結果表明，菌種比、水料比和發酵溫度對杏仁粕曲料的風味都有影響，其影響程度由大到小依次為溫度、水料比、米曲霉與黑曲霉質量比.當米曲霉與黑曲霉質量比(g﹕g)3﹕1、溫度30℃、水料比(mL﹕g)0.5﹕1，發酵5d成曲的氨基態氮含量為1.25%、風味強度為80.00，杏仁粕曲料風味較好.對曲料進行揮發性風味成分進行分析，曲料風味物質主要為苯甲醛、苯甲醇、3–辛酮、苯甲酸甲酯和苯甲酸乙酯.與未發酵相比，發酵的杏仁粕顏色加深、風味加強，這為進一步研究發酵杏仁粕曲料風味，提高其應用價值奠定了基礎.