FOXA2過表達對卵巢癌OVCAR3細胞上皮-間充質轉化的抑制作用及機制研究

王凱 郭盼盼 管陳安 孫依娜 王俊強 余軍輝

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居婦科惡性腫瘤的第二位，死亡率高居首位，是最致命的婦科惡性腫瘤[1]。由于缺乏有效的篩查和早期診斷方法，大多患者確診時已處于晚期階段，雖然可進行腫瘤細胞減滅術輔以順鉑和紫杉醇為主的化療，但臨床緩解的平均時間為2年，5年生存率僅為45%[2]。卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展與各種癌基因或抑癌基因異常表達密切相關。

上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指在某些生理或病理狀態(tài)下出現(xiàn)的上皮細胞向間質細胞表型轉變的過程。多項研究表明，EMT在腫瘤進展、癌細胞侵襲、胚胎的發(fā)育和器官的形成、傷口愈合及纖維化等一系列生理病理過程中起關鍵作用[3-5]。在腫瘤的發(fā)展及癌細胞的侵襲過程中，EMT降低了細胞之間的黏附性，增強了細胞的侵襲、遷移、抵抗化療藥物的能力[6]。這一過程中上皮性細胞標志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達下調(diào)，間質標志物波形蛋白（Vimentin）表達上調(diào)。參與介導EMT的分子機制及信號通路多種多樣，其中Wnt/β-catenin的激活能明顯增強EMT相關轉錄因子Snail超家族鋅指轉錄因子（Snail family zinc finger，SNAI）、Twist家族 BHLH 轉錄因子 （Twist family BHLH transcription factor，Twist）和鋅指E盒同源結合蛋白（zinc finger E-box binding homeobox,ZEB）表達，進而增強腫瘤細胞的侵襲轉移能力[7]。

叉頭框蛋白 A2（Forkhead-box protein A2，F(xiàn)OXA2）又稱為肝細胞核因子3β，為DNA結合蛋白，其在胚胎發(fā)育的多個環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用。同時研究也表明，F(xiàn)OXA2是一個潛在的EMT調(diào)控靶點，F(xiàn)OXA2與多種惡性腫瘤如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、食管癌等的發(fā)生、發(fā)展密切相關[8-10]。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)FOXA2在卵巢癌組織中較癌旁正常組織中明顯下調(diào)，且陰性表達者5年病死率較高，說明FOXA2可能作為卵巢癌診斷以及預后的生物標志物[11]，但其對卵巢癌及EMT的具體作用及相關分子機制仍不清楚。本研究通過檢測過表達FOXA2的卵巢癌細胞的增殖、侵襲能力和EMT發(fā)生相關蛋白 E-cadherin和 Vimentin及 Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白β-catenin的表達情況，探討FOXA2過表達對卵巢癌細胞EMT的抑制及可能的作用機制，以期為卵巢癌的早期診斷和治療以及生物標志物的臨床應用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料 人卵巢癌細胞系OVCAR3和正常卵巢上皮細胞IOSE80購買于中國科學院上海細胞庫。FOXA2基因序列（基因序列號：NM_021784.5）由生工生物工程（上海）股份有限公司進行全基因合成。FOXA2 pcDNA3.1質粒載體購自美國Invitrogen公司。RIPA buffer（含蛋白酶和磷酸酶抑制劑）購自美國Thermo Fisher公司。PVDF膜購自美國GE Healthcare公司。EndoFree Plasmid Maxi Kit購自德國Qiagen公司。一抗rabbit anti-E-cadherin和rabbit anti-Vimentin均購自美國CST公司。二抗Alexa Fluor594 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG均購自美國Jackson ImmunoResearch公司。一抗rabbit anti-FOXA2、rabbit anti-β-catenin、rabbit anti-H3 Histone（細胞核內(nèi)參）以及細胞質內(nèi)參GAPDH rabbit anti-GAPDH（內(nèi)參）購自美國Abcam公司。二抗山羊抗兔IgG-HRP及持久性化學發(fā)光底物SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate購自美國Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 正常卵巢上皮細胞IOSE80和卵巢癌細胞系OVCAR3的培養(yǎng)和傳代 人卵巢癌細胞系OVCAR3和正常卵巢上皮細胞IOSE80分別采用RPMI 1640培養(yǎng)液以及DMEM高糖培養(yǎng)液（含10% FBS以及雙抗）進行復蘇，在37℃、5% CO2條件下進行培養(yǎng)至融合度90%左右，用胰酶消化，按1∶3傳代，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 IOSE80、OVCAR3細胞FOXA2 mRNA表達水平檢測 采用real-time PCR法。收集兩種細胞，采用TRIzol試劑提取總RNA，然后按QuantiTectReverse Transcription Kit說明書合成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，采用PowerUp SYBRTMGreen Master Mix試劑盒進行real-time PCR擴增。具體引物序列見表1。PCR反應體系：10 μl PowerUp SYBRTMGreen Master Mix，4 μl cDNA（cDNA原液按照1：10稀釋），0.5 μl正向引物（10 μmol/L），0.5 μl反向引物（10 μmol/L），補加 H2O 至 20 μl。反應條件：95 ℃，1 min；95 ℃，15 s；60 ℃，25 s；共40個循環(huán)。每個實驗重復3次，每個樣品設置3個復孔，其相對表達量采用 2-ΔΔCt法進行計算。

表1 引物序列

1.2.3 FOXA2-pcDNA3.1過表達載體的構建及轉染 按照FOXA2基因序列（基因序列號：NM_021784.5），由生工生物工程公司進行全基因合成，同時基因兩端引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點。將FOXA2合成產(chǎn)物和 pcDNA3.1質粒分別用BamHⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切、純化、連接，并轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，37℃培養(yǎng)過夜；提取FOXA2-pcDNA3.1重組質粒后進行測序鑒定。鑒定無誤后，采用無內(nèi)毒素質粒大提試劑盒EndoFree Plasmid Maxi Kit進行 FOXA2-pcDNA3.1過表達質粒以及pcDNA3.1對照質粒的提取用于后續(xù)的轉染實驗。細胞轉染按照LipofectamineTM3000說明書分別轉染FOXA2-pcDNA3.1過表達質粒和pcDNA3.1對照質粒，并設未轉染質粒的空白對照組，8 h后換成新鮮完全培養(yǎng)液，48 h后提取總RNA用于后續(xù)分析過表達效率，72 h后提取蛋白用于后續(xù)Western blot檢測。

1.2.4 OVCAR3轉染細胞中FOXA2過表達效率檢測采用real-time PCR法。收集對照質粒pcDNA3.1以及重組質粒FOXA2-pcDNA3.1轉染后的細胞，總RNA提取、逆轉錄以及定量PCR檢測同方法1.2.2。

1.2.5 細胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。將轉染pcDNA3.1對照質粒以及FOXA2-pcDNA3.1過表達質粒24 h后的OVCAR3細胞進行消化收集，細胞計數(shù)并調(diào)整細胞密度。按每孔2×103/100 μl細胞密度接種96孔板，待細胞貼壁后記為0 h，分別在0、24、48和72 h后加入10 μl CCK-8，在37℃、5% CO2條件下孵育2 h后用酶標儀檢測450 nm處的吸光度值以反映細胞增殖能力。每組均作6個復孔，取平均值。

1.2.6 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell實驗。取出Matrigel Invasion Chamber 24 Well恢復到室溫，隨后加入500 μl無血清培養(yǎng)基，37℃孵育2 h，水化基底膜，吸去多余液體備用。將轉染pcDNA3.1對照質粒以及FOXA2-pcDNA3.1過表達質粒24 h后的OVCAR3細胞進行消化收集，采用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞濃度至 2×105/ml，上室加入 200 μl細胞懸液，下室加入 600 μl含 15% FBS細胞培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h后4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色30 min，PBS清洗后，倒置顯微鏡拍照計數(shù)。每個組設置3個復孔，每個復孔200倍隨機選取5個視野，統(tǒng)計侵襲細胞的平均數(shù)。

1.2.7 E-cadherin和Vimentin定位與表達檢測 采用細胞免疫熒光實驗。將無菌細胞爬片置于12孔板中，取對數(shù)生長期的OVCAR3細胞接種于爬片上，當細胞匯合度為50%時，4%多聚甲醛固定爬片，經(jīng)0.5% Triton X-100/PBS作用5 min，PBS漂洗后加入10%正常驢血清封閉30 min，然后滴加稀釋的一抗rabbit anti-E-cadherin（1∶200）和 rabbit anti-Vimentin（1∶200），4 ℃濕盒孵育過夜，陰性對照以PBS代替一抗；PBS漂洗后，滴加稀釋的熒光二抗。二抗信息：Alexa Fluor594 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG（1∶200），4 ℃濕盒暗處孵育 1 h，PBS漂洗后4'6-二脒基-2-苯基吲哚（4'6-diamidino-2-phenylindole，DAPI） 染色 5 min，PBS 再次漂洗后，抗熒光淬滅劑封片。使用激光共聚焦觀察594 nm（紅色激發(fā)波長）顯示的熒光并拍照。

1.2.8 EMT相關蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。上述細胞收集后，加入150 μl RIPA buffer（含蛋白酶和磷酸酶抑制劑）提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取每個樣品約50 μg蛋白置于10%SDS-PAGE電泳分離，100 V恒壓電轉至PVDF膜，然后加入5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。分別加入相應一抗∶rabbit anti-E-cadherin（1∶2 000）、rabbit anti-FOXA2（1∶2 000）、rabbit anti-Vimentin（1∶2 000）以及 rabbit anti-GAPDH(內(nèi)參，1∶1 000，4 ℃孵育過夜。用 TTBS洗膜 3次（每次5 min），加入山羊抗兔 IgG-HRP二抗（1∶5 000），室溫反應 1 h。用TTBS洗膜4次（每次5 min），滴加SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate后暗室曝光X-film進行顯影，圖像采用Image Pro Plus 6.0軟件分析條帶的光密度，并以GAPDH為內(nèi)參進行結果分析。每個實驗重復3次。

采用NE-PERTMNuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents分離細胞質和細胞核蛋白，然后進行BCA定量。Western blot檢測方法同上。一抗信息：rabbit anti-βcatenin（1∶4 000）、rabbit anti-H3 Histone（1∶5 000）（細胞核內(nèi)參）以及細胞質內(nèi)參GAPDH。

2 結果

2.1 OVCAR3細胞與IOSE80細胞FOXA2 mRNA表達水平比較 與IOSE80細胞相比，OVCAR3細胞FOXA2 mRNA表達水平下調(diào)了5.023倍（P＜0.05），見圖1。因此，后續(xù)實驗采用OVCAR3細胞過表達FOXA2，探究FOXA2過表達對該細胞的EMT發(fā)生的影響。

圖1 OVCAR3細胞與 IOSE80細胞叉頭框蛋白 A2（FOXA2）mRNA表達水平比較

2.2 FOXA2-pcDNA3.1重組載體鑒定、OVCAR3細胞FOXA2過表達效率 通過對全基因合成的FOXA2-pcDNA3.1重組質粒進行測序，測序結果與NCBI數(shù)據(jù)庫的序列比對完全一致，表明成功構建了FOXA2-pcDNA3.1過表達載體。與轉染pcDNA3.1對照質粒組及未轉染質粒的空白對照組相比，轉染FOXA2-pcDNA3.1重組質粒組OVCAR3細胞FOXA2表達水平上調(diào)了18.84倍（P＜0.05），見圖 2。

圖2 轉染FOXA2-pcDNA3.1重組質粒組、轉染pcDNA3.1對照質粒組及未轉染質粒的空白對照組OVCAR3細胞叉頭框蛋白A2（FOXA2）mRNA表達水平比較

2.3 轉染FOXA2-pcDNA3.1重組質粒組、轉染pcDNA3.1對照質粒組及未轉染質粒的空白對照組的OVCAR3細胞增殖能力比較 細胞培養(yǎng)48 h后，與轉染pcDNA3.1對照質粒組和未轉染質粒的空白對照組相比，轉染FOXA2-pcDNA3.1重組質粒組OVCAR3細胞增殖能力明顯下降（P＜0.05），見圖3。

圖3 轉染FOXA2-pcDNA3.1重組質粒組、轉染pcDNA3.1對照質粒組及未轉染質粒的空白對照組OVCAR3細胞增殖能力比較

2.4 轉染FOXA2-pcDNA3.1重組質粒組、轉染pcDNA3.1對照質粒組及未轉染質粒的空白對照組的OVCAR3細胞侵襲能力比較 與轉染pcDNA3.1對照質粒組和未轉染質粒的空白對照組相比，轉染FOXA2-pcDNA3.1重組質粒組OVCAR3細胞穿過基底膜的細胞數(shù)量明顯下調(diào)（P＜0.05），表明過表達FOXA2使OVCAR3細胞的侵襲能力明顯減弱，見圖4。

圖4 轉染FOXA2-pcDNA3.1重組質粒組、轉染pcDNA3.1對照質粒組及未轉染質粒的空白對照組OVCAR3細胞侵襲能力比較[a：Transwell實驗顯微鏡下所見（×100）；b：穿過基底膜的細胞數(shù)量比較]

2.5 轉染FOXA2-pcDNA3.1重組質粒組、轉染pcDNA3.1對照質粒組及未轉染質粒的空白對照組OVCAR3細胞 FOXA2、E-cadherin、Vimentin蛋白表達水平比較 與轉染pcDNA3.1對照質粒組和未轉染質粒的空白對照組相比，轉染FOXA2-pcDNA3.1重組質粒組OVCAR3細胞FOXA2、E-cadherin蛋白表達水平均明顯上調(diào)（均 P＜0.05），而 Vimentin表達水平下調(diào)（P＜0.05），見圖5。細胞免疫熒光檢測E-cadherin和Vimentin定位及表達，結果顯示兩種蛋白（紅色熒光）主要定位在細胞質，DAPI（藍色熒光）定位在細胞核。與轉染pcDNA3.1對照質粒組和未轉染質粒的空白對照組相比，轉染FOXA2-pcDNA3.1重組質粒組OVCAR3細胞E-cadherin陽性信號明顯增強，而Vimentin陽性信號明顯減弱，見圖6（插頁）。即OVCAR3細胞中，過表達FOXA2明顯抑制EMT發(fā)生、發(fā)展。

圖5 轉染FOXA2-pcDNA3.1重組質粒組與轉染pcDNA3.1對照質粒組及未轉染質粒的空白對照組的OVCAR3細胞叉頭框蛋白A2（FOXA2）、E- 鈣黏蛋白（E-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）表達水平比較

圖6 E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）在OVCAR3細胞中的定位和表達（藍色代表DAPI細胞核染色；紅色代表E-cadherin和Vimentin細胞質染色；×630）

2.6 轉染FOXA2-pcDNA3.1重組質粒組、轉染pcDNA3.1對照質粒組及未轉染質粒的空白對照組OVCAR3細胞β-catenin蛋白表達水平比較 與轉染pcDNA3.1對照質粒組和未轉染質粒的空白對照組相比，轉染FOXA2-pcDNA3.1重組質粒組OVCAR3細胞β-catenin在細胞質中大量積累，而在細胞核中顯著減少（P＜0.05），見圖7。即OVCAR3細胞中，過表達FOXA2可以顯著抑制Wnt/β-catenin信號通路。

圖7 轉染FOXA2-pcDNA3.1重組質粒組、轉染pcDNA3.1對照質粒組及未轉染質粒的空白對照組OVCAR3細胞β-連環(huán)蛋白（β-catenin）表達水平比較

3 討論

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，但病死率卻高居首位。由于卵巢癌發(fā)病隱匿，缺乏典型的癥狀及有效的卵巢癌篩查生物標志物，被診斷時大多患者已經(jīng)處于卵巢癌的晚期階段，嚴重威脅著女性的生命健康[12-13]。因此，探尋有效的卵巢癌生物標志物及發(fā)病機制是當下的研究熱點。

FOXA2基因位于人的20號染色體上，由3個外顯子及2個內(nèi)含子構成，全長45 kb，包含兩段轉錄激活區(qū)域、保守的叉頭框區(qū)域以及抑制區(qū)和磷酸化區(qū)[14]。FOXA2作為FOXA家族中的一員在胚胎發(fā)育、能量代謝、惡性腫瘤的發(fā)生、增殖、浸潤及轉移等過程中發(fā)揮重要作用，同時當FOXA1不足時，F(xiàn)OXA2可以代替FOXA1的功能[15]。在不同的腫瘤中，F(xiàn)OXA2的表達及其作用均不相同。FOXA2的表達情況與腫瘤發(fā)生以及惡性轉化過程高度相關，而且FOXA2可以通過直接結合在E-cadherin的啟動子上激活其表達[16-18]。張震[19]的研究顯示FOXA2是乳腺癌E型細胞的相關因子，抑制EMT過程；李正平等[20]研究發(fā)現(xiàn)FOXA2是通過上調(diào)E-cadherin表達，下調(diào)基質金屬蛋白酶（matrix metalloprotein，MMP）基因表達，進一步抑制EMT過程來實現(xiàn)對肝癌細胞浸潤轉移的抑制。張正良等[21]發(fā)現(xiàn)FOXA2通過抑制EMT過程進而抑制胃癌的發(fā)生、發(fā)展。然而Song等[22]發(fā)現(xiàn)FOXA2在胰腺癌中促進EMT發(fā)生，增加細胞活性誘發(fā)腫瘤轉移，從而誘發(fā)胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展，本研究中FOXA2抑制卵巢癌OVCAR3細胞的增殖和侵襲，該結果與已有研究結果相符。另外本研究結果顯示過表達FOXA2會促進E-cadherin蛋白表達，抑制Vimentin蛋白表達，進而抑制EMT過程。說明FOXA2可能通過抑制EMT過程抑制卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展。

Wnt/β-catenin信號通路是高等動物胚胎發(fā)育分化過程中的重要信號通路，可以調(diào)控相關靶基因參與細胞的增殖、分化、極化、侵襲、凋亡等過程。同時Wnt/βcatenin通路異常也與惡性腫瘤的發(fā)生相關，通常表現(xiàn)為正常表達于細胞膜的β-catenin蛋白發(fā)生細胞質聚集與細胞核異位表達[23]。有研究表明，β-catenin蛋白在卵巢癌組織中異位聚集表達明顯高于癌旁正常組織，說明卵巢癌中存在Wnt/β-catenin通路的活化[24]。而本研究中過表達FOXA2，卵巢癌OVCAR3細胞中β-catenin蛋白在細胞核與細胞質中明顯增加，可能激活了Wnt/βcatenin信號通路。這說明過表達FOXA2可能通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路從而影響EMT過程，進而抑制卵巢癌細胞的增殖和侵襲能力。

綜上所述，F(xiàn)OXA2過表達可能通過Wnt/β-catenin信號通路影響EMT過程，進而抑制卵巢癌OVCAR3細胞的增殖和侵襲能力。本研究可能為卵巢癌的診斷、治療以及預后生物標志物的選擇提供參考。然而，F(xiàn)OXA2的功能及其在卵巢癌發(fā)生中的作用及其具體作用機制還有待進一步研究。