基于數據庫探討NEDD8在頭頸鱗癌中的表達及其預后價值

顧姍姍 鄧紅霞 沈志森

頭頸鱗癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）占頭頸部腫瘤的90%以上，是第六大常見的惡性腫瘤，全球每年的新發病例和死亡病例分別超過89萬和45萬[1-2]。盡管近年來外科手術及放化療等多種治療手段有了很大進步，但HNSCC的5年生存率仍僅約50%，超過70%的患者會出現不同程度的復發及淋巴結轉移[3-4]。HNSCC是一種異質性上皮腫瘤，與抽煙、飲酒有密切相關性[5]。HNSCC的發病過程較為復雜，涉及到多個分子與細胞的相互作用；且由于其涉及部位多，目前尚缺乏理想的特異性生物標志物。篩選HNSCC相關基因有望為其診治提供新思路，為其診斷和預后提供候選的生物標志物和治療靶點。

神經前體細胞表達下調因子8（neural precursor cellexpressed developmentally down regulated 8，NEDD8）是一種類泛素蛋白，最早發現于小鼠大腦中，其含有81個氨基酸，與泛素分子結構最為接近，同源性達到60%[6-7]。NEDD8參與蛋白類泛素化修飾，在調節相關轉錄因子活性、信號轉導和腫瘤發生等生命活動中起重要作用。既往研究表明，NEDD8在肺癌、肝癌、子宮內膜癌等多種腫瘤中異常表達，并與腫瘤的發生、發展及預后判斷密切相關[8]。但NEDD8基因在HNSCC中的潛在生物標志物價值尚不明確。微陣列和RNA測序技術的進步為生物醫學研究提供了大量數據。本研究通過癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和多種公共數據庫探索HNSCC患者NEDD8基因的表達、突變和生物學功能情況，預測其在HNSCC中的預后價值，以期為HNSCC預后判斷和治療新靶點選擇提供參考。

1 材料和方法

1.1 檢索Oncomine數據庫 Oncomine（www.oncomine.org）數據庫包含715個基因表達數據集和86 733個樣本，是全球最大的癌基因芯片數據庫和數據挖掘平臺[9]。本研究利用該數據庫比較NEDD8在HNSCC組織和正常組織中的表達；以改變倍數閾值＞1.5，基因排序為前10%，P＜0.05為差異有統計學意義。

1.2 檢索UALCAN數據庫 UALCAN數據庫（http://ualcan.path.uab.edu/）是一個TCGA數據庫在線分析和挖掘的網站，其基于TCGA基因表達數據提供基因在不同腫瘤亞群中的表達，如性別、年齡、腫瘤分期等，也提供基因生存分析、相關性分析和DNA啟動子區甲基化數據分析[10]。本研究通過UALCAN數據庫分析HNSCC中NEDD8的表達及其與HNSCC臨床病理參數的關系，以P＜0.05為差異有統計學意義。

1.3 檢索GEPIA數據庫 基因表達譜數據動態分析GEPIA 數據庫（http://gepia.cancer-pku.cn/）是北京大學開發的用于癌癥和正常基因表達譜分析的公共數據庫，包括9 736個腫瘤樣本和8 587個正常樣本的RNA測序表達數據[11]。本研究通過GEPIA數據庫分析NEDD8在HNSCC中的生存預后評估價值。

1.4 Kaplan-Meier Plotter分析 采用Kaplan-Meier Plotter（http://kmplot.com/analysis/）在線分析不同NEDD8基因表達水平HNSCC患者的總生存期（overall survival，OS）和無復發生存期（relapse-free survival，RFS）[12]。分別根據NEDD8基因中位表達水平將HNSCC患者分為高表達和低表達兩組，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線評估OS和RFS。

1.5 檢索cBioPortal數據庫 cBioPortal數據庫（http://www.cbioportal.org）是一個可視化和分析多維癌癥基因組數據的綜合性開放平臺，目前包含245項癌癥研究[13]。本研究利用該平臺中488例HNSCC患者的基因表達信息，分析NEDD8基因突變率和患者生存預后情況。

1.6 檢索LinkedOmics數據庫LinkedOmics（http://linkedomics.org）是一個含有TCGA 32種癌癥多組學數據的公共平臺，包括 LinkFinder、LinkInterpreter、LinkCompare 3個分析模塊[14]。本研究利用該平臺的LinkFinder模塊研究TCGA HNSC隊列（520例）中NEDD8相關的差異表達基因，使用Pearson相關分析進行統計學處理。然后使用LinkInterpreter模塊對差異基因進行基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 通路富集分析。假陽性發現率（false discovery rate，FDR）＜0.05，模擬1 000次。

2 結果

2.1 NEDD8 mRNA在HNSCC組織中的表達情況 Oncomine數據庫分析結果顯示，NEDD8 mRNA在乳腺癌、頭頸部腫瘤、淋巴瘤等腫瘤中高表達，而在前列腺癌和白血病等腫瘤中低表達，差異具有統計學意義（P＜0.05），見圖1（插頁）。同時，在HNSCC 6個分析結果中，NEDD8 mRNA均是高表達（均P＜ 0.05），見表1。

圖1 Oncomine數據庫常見腫瘤組織中神經前體細胞表達下調因子8（NEDD8）mRNA的表達情況

表1 Oncomine數據庫NEDD8 mRNA在HNSCC中表達的差異

通過UALCAN數據庫對520例TCGA中HNSCC樣本驗證發現NEDD8 mRNA的表達水平顯著高于正常組織（P＜0.05），見圖2a。在基于疾病分期、腫瘤分級、淋巴轉移分期、患者性別、年齡、種族的亞組分析中，HNSCC患者的NEDD8 mRNA表達上調（P＜0.05），見圖2b-g。此外，TP53突變的HNSCC患者較TP53不突變患者有著較高的NEDD8 mRNA表達量（P＜0.05），見圖2h。因此，NEDD8可能是HNSCC潛在的生物標志物。

圖2 神經前體細胞表達下調因子8（NEDD8）mRNA在頭頸鱗癌（HNSCC）組織中的差異表達

2.2 NEDD8 mRNA表達與HNSCC患者預后的關系分析 采用GEPIA數據庫和Kaplan-Meier Plotter雙重驗證NEDD8 mRNA表達與HNSCC患者預后的關系。GEPIA數據庫顯示，高表達NEDD8 mRNA的HNSCC患者OS偏短[P＜0.05，見圖3a（插頁）]，無病生存期更短[P＜0.05，見圖 3b（插頁）]。Kaplan-Meier Plotter在線分析結果顯示，同樣NEDD8 mRNA高表達組的患者OS顯著短于低表達組[P＜0.05，見圖 3c（插頁）]，而 NEDD8 mRNA表達與HNSCC患者的RFS未見無明顯相關[P＜0.05，見圖 3d（插頁）]。這提示 NEDD8 mRNA 表達與HNSCC的預后相關，高表達的患者預后較差。

圖3 不同神經前體細胞表達下調因子8（NEDD8）mRNA表達水平頭頸鱗癌（HNSCC）患者生存曲線比較（a、b：GEPIA 數據庫分析；c、d：Kaplan-Meier Plotter在線分析）

2.3 NEDD8突變與HNSCC預后的關系分析 基于cBioPortal數據庫分析HNSCC測序數據發現，488例HNSCC患者中NEDD8基因發生改變28例，突變率為6%，主要表現為mRNA上調、擴增、深度缺失等，見圖4a（插頁）。然而，生存曲線圖和log-rank檢驗顯示，NEDD8基因突變與HNSCC患者OS[見圖4b（插頁）]、無進展生存期[見圖 4c（插頁）]或無病生存期[見圖 4d（插頁）]均無關（均P＞0.05）。

圖4 神經前體細胞表達下調因子8（NEDD8）在頭頸鱗癌（HNSCC）中的突變和生存分析

2.4 HNSCC中NEDD8共表達基因的GO和KEGG通路分析 使用LinkedOmics數據庫分析TCGA中520例HNSCC患者的mRNA測序數據。火山圖中用t檢驗分析NEDD8與HNSCC差異表達基因之間的聯系，見圖5a（插頁）。熱圖分別顯示50個與NEDD8顯著正相關或負相關的基因（P＜0.05），見圖 5b、c（插頁）。其中NEDD8 表達與 MRPL52（r=0.8666）、RPL36AL（r=0.8184）、DAD1（r=0.8041）表達均呈正相關（均 P＜0.05），見圖5d、e、f（插頁）。GO通路分析顯示與NEDD8相關的差異表達基因主要參與翻譯延伸、線粒體呼吸鏈復合體組裝和蛋白折疊等，見圖5g（插頁）；KEGG通路分析顯示，其在核糖體、蛋白運輸和嘧啶代謝等方面富集，見圖5h（插頁）。此外，GO和KEGG通路分析得出了與NEDD8相關且最重要的前4個激酶、miRNA和轉錄因子靶網絡，結果表明對激酶靶點、miRNA靶點和轉錄因子靶點基因集富集得分貢獻最大的基因成員數分別是絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、GTGCCTT、MIR-506、TTGTTT_V$FOXO4_01，見表2。

圖5 LinkOmics數據庫分析頭頸鱗癌（HNSCC）中神經前體細胞表達下調因子8（NEDD8）共表達基因（GO為基因本體論；KEGG為京都基因與基因組百科全書）

表2 HNSCC中NEDD8的激酶、miRNA和轉錄因子靶點

3 討論

NEDD8最早于1992年在小鼠腦組織中被發現，通過類泛素化過程與底物蛋白共價結合，調控其生物性質。類泛素化修飾最具特征的底物是cullin家族蛋白，它是CRLs E3泛素復合體的骨架蛋白[19]。NEDD8也可與許多非 cullin 蛋白底物結合，如 p53、p73、BCA3、VHL，趨化因子受體CXCR5等[20-21]。因此，NEDD8在細胞定位、調節相關轉錄因子活性和增加蛋白穩定性等方面起重要作用。研究表明NEDD8的過表達及類泛素化的異常激活與人類多種腫瘤、炎癥和自身免疫性疾病的發生、發展相關。值得注意的是，在肺腺癌和鱗狀細胞癌中，NEDD8通路的大多數酶都被過度激活，且與患者不良預后呈顯著相關[22]。但是，目前關于NEDD8在HNSCC中的作用還未明確。因此，本研究利用生物信息學分析NEDD8在HNSCC中的表達、患者臨床病理特征和預后價值，以期為今后HNSCC的調控機制和精準治療研究提供指導。

本研究通過Oncomine數據庫挖掘NEDD8在常見腫瘤中的表達情況，發現其在HNSCC中高表達。再次用UALCAN數據庫驗證發現NEDD8的表達量顯著高于正常組織，且與患者臨床腫瘤分期、病理腫瘤分級、淋巴結轉移分期等顯著相關。生存曲線結果表明高表達NEDD8的HNSCC患者OS顯著縮短，HNSCC患者預后不良，提示NEDD8可能是一個促癌基因。此外，進一步檢索488例HNSCC組織RNA測序結果發現，NEDD8基因在HNSCC中的變異率較低，且變異類型以mRNA上調為主，但其變異與否與患者預后無明顯相關性。通過LinkedOmics數據庫探索頭頸鱗癌中NEDD8共表達基因，并用GSEA進行富集分析，GO分析顯示與NEDD8相關的差異表達基因主要參與翻譯延伸、線粒體呼吸鏈復合體組裝和蛋白折疊等；KEGG通路分析顯示，其在核糖體、蛋白運輸和嘧啶代謝等方面富集。隨后，本研究用富集分析目標基因集，確定了重要的目標激酶、miRNAs和轉錄因子網絡。本研究結果發現NEDD8在HNSCC中與MAPK1、HCK、MAPK3和ATM激酶相關，這些激酶調控腫瘤信號通路、細胞增殖和細胞周期。研究表明，過表達miR-506通過下調轉錄抑制因子SNAI2來抑制胃癌細胞的增殖和遷移[23]，這為臨床了解癌癥的發生、發展提供了思路。

綜上所述，本研究通過挖掘常見數據庫，初步明確了NEDD8基因在HNSCC的表達、變異情況及其預后診斷價值。本研究的結論基于轉錄水平得出，后續筆者團隊將進一步在蛋白水平上對NEDD8的表達及功能進行驗證，探究NEDD8調控頭頸鱗癌發生、發展的作用機制，為頭頸鱗癌的預后判斷和治療新靶點提供理論參考。