拮抗銅綠假單胞菌的乳酸菌篩選及機制研究

李建周 肖堯婷 李紅霄 陳曉華,,4 李安平

(1.中南林業科技大學食品學院，湖南 長沙 410004；2.衡陽師范學院南岳學院，湖南 衡陽 421002；3.衡陽師范學院生命科學與環境學院，湖南 衡陽 421008；4.衡陽師范學院南岳山區生物資源保護與利用湖南省重點實驗室，湖南 衡陽 421008)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)又稱綠膿桿菌，是典型的條件致病菌[1]，同時也是重要的食源性致病菌，其產生的毒力因子可引起食物中毒和飲用水的污染，導致患者產生頭暈、嘔吐和腹瀉等癥狀[2-3]。由于PA具有內源性、獲得性和適應性多重耐藥機制，常導致多重耐藥性PA菌株的出現和抗生素治療的失敗[4]。2017年世界衛生組織將耐碳青霉烯的PA列為迫切需要開發新抗菌藥物治療的細菌之一。因此，開發新的抗菌藥物和尋找天然具有抗菌作用的替代物是臨床PA治療的理想選擇。

乳酸菌(Lacticacidbacteria，LAB)是一類對人體有益的重要微生物，被公認為是安全的食品級微生物。LAB在自然界中廣泛存在，土壤、食品以及人體、畜禽腸道內均含有LAB。LAB代謝過程中產生的有機酸抗菌肽，可抑制病原微生物生長繁殖、調節腸道微生物菌群平衡，從而對宿主的營養狀態、生理功能、應激反應等產生作用。目前臨床中許多益生LAB已被用來預防或治療各種胃腸疾病，包括感染性腹瀉、新生兒腸炎、慢性結腸炎、腸易激綜合癥和炎癥性腸病[5]。

微生物通過群體感應系統(QS)協調群體行為，其中存在多種QS系統，革蘭氏G+和革蘭氏G-中都存在的自誘導物AI-2，是不同種屬細菌間通訊交流的通用信號分子。AI-2是一種呋喃酮類化合物，為對稱的雙五圓環結構的呋喃酮酰硼酸二酯，是甲硫氨酸循環通路——甲基循環的一個副產品。目前已知70多個種屬的細菌基因組中含有luxS的同源序列，并且AI-2的生物合成途徑基本相似。微生物菌群中AI-2信號分子的表達受AI-2/LuxS QS系統調控，且參與QS的luxS基因可調控LAB的生理活性[6]，LAB的抑菌機制與AI-2/LuxS的表達系統有關[7-8]。QS系統可以調控LAB的多項重要生理功能，如調控菌體生物膜的形成[9]、胞外酶的合成[10]、抗菌肽的合成[11]、腸道定殖能力[12]等。Park等[13]發現從泡菜中篩選出的清酒乳桿菌(Lactobacillussakei)NR28 對大腸埃希氏桿菌(Escherichiacoli)ATCC43894的AI-2具有淬滅作用，能達到降低致病性的目的。陳小春等[14]研究發現太平洋桿菌可通過抑制PA的QS系統降低PA毒力因子的表達。Rana等[15]利用LAB(乳酸乳球菌、發酵乳桿菌和鼠李糖乳桿菌)上清液抑制PAO1信號分子AHL的表達，從而抑制彈性蛋白酶活性，降低PA生物膜的形成。Chappell等[16]通過構建乳桿菌工程菌，表達降解PA生物膜的酶，抑制PA生物膜的形成。綜上，LAB有抑制PA的作用，但LAB抑制PA的作用機制尚未明晰。

研究擬篩選抑制PA的LAB，通過測定LAB群體感應信號分子AI-2的表達，LAB抑制PA生物膜形成、綠膿菌素(PYO)表達及LAB無菌上清液與PA共培養時AI-2信號分子的表達探討LAB拮抗PA的機制。旨在為乳桿菌拮抗PA的機制研究提供新的思路，也為乳桿菌益生特性的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養基

12株LAB(其中6株來源于泡菜，2株來源于腐乳，2株來源于雞糞便，1株來源于發酵米，1株來源于酸奶)、銅綠假單胞菌(PAO1)、哈維氏弧菌(VibrioharveyiBB170, BB152)大腸桿菌(EscherichiacoliDH5α)：實驗室保存菌株；

LAB培養用MRS培養基、AO1用LB培養基、BB170和BB152用海生培養基、DH5α用LB培養基：青島海博生物技術有限公司。

1.2 菌株的培養及上清液制備

LAB按體積分數2%接種于MRS培養基中，37 ℃活化3代，繼續培養18 h；PAO1按體積分數1%接種于LB培養基，37 ℃活化3代，繼續培養18 h；BB170、BB152按體積分數2%接種于AB培養基中，30 ℃活化3代，繼續培養12 h；DH5α按體積分數1%接種于LB培養基中，30 ℃活化3代，繼續培養18 h。以上菌株獲得培養液后，6 000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm過濾器過濾，獲得試驗菌株的無菌上清液，于-80 ℃超低溫冰箱保存備用。

1.3 共培養物上清液的制備

將LAB上清液、MRS培養基上清液、DH5α上清液以及LB培養基上清液分別按V上清液∶VPA菌液=1∶1分別接入濃度為106CFU/mL的PA菌液中，培養24 h，6 000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm濾菌器過濾，得到無菌共培養上清液，于-80 ℃超低溫冰箱保存備用。

1.4 LAB抑菌能力測定

參照Chappell等[16]的方法并稍作修改。將質量分數2%瓊脂滅菌后倒入平板中，凝固后放入4個無菌牛津杯，倒入濃度約為106CFU/mL的PA菌液，待凝固后，用鑷子夾出。取200 μL LAB上清液加入到牛津杯孔中，37 ℃培養24 h，測定抑菌圈直徑。每個樣品做3個平行，重復3次。以MRS培養基(pH 4.0)作為空白對照。抑菌圈直徑>15 mm判定為高度敏感；抑菌圈直徑為11～15 mm 判定為中度敏感；抑菌圈直徑為5～10 mm 判定為低度敏感；抑菌圈直徑為4 mm 判定為不敏感[17]。

1.5 信號分子AI-2的檢測

參照蔡針華等[18]的方法稍作修改。將BB170按體積分數2%接種于海生培養基，30 ℃培養12 h，至菌體OD600 nm為0.8～1.2，用新鮮的AB培養基以1∶100稀釋BB170培養液，充分震蕩混勻后備用。將LAB上清液、BB152無菌上清液、DH5α無菌上清液和BB170培養稀釋液分別作為待測樣品、陽性對照、陰性對照和介質對照，各4個平行。按體積比1∶100與稀釋后的BB 170培養液混合培養3.5 h，測定化學發光值。用相對熒光強度表示信號分子AI-2的強度，分別按式(1)和式(2)進行計算。

(1)

(2)

式中：

NAI-2——陰性對照組相對熒光強度；

FI,1——陰性對照組熒光強度；

FI,2——陽性對照組熒光強度；

TAI-2——待測組相對熒光強度；

FI,3——待測樣品熒光強度；

FI,4——介質對照組熒光強度。

1.6 綠膿菌素(PYO)的測定

參照Lou等[19]的方法稍作修改。將共培養物上清液于-80 ℃超低溫冰箱中預凍2 h后凍干濃縮。加入3 mL三氯甲烷，待完全溶解后加入1 mol/L的鹽酸1 mL，充分振蕩后靜置。待分層后取鹽酸層測定其OD520 nm，此OD520 nm即表示PYO含量。

1.7 生物膜的測定

參照張立冬等[20]的方法并稍作修改。PA按體積分數1%接種于LB培養基，37 ℃培養18 h后，用LB培養基按1∶100稀釋，充分震蕩備用。將LAB上清液按體積比1∶100與稀釋后的PA培養液混勻，移取200 μL至96孔酶標板中，37 ℃培養18 h，倒掉菌液，用PBS沖洗4次，烘干。吸取200 μL結晶紫染液染色10 min，倒出染色劑再用PBS沖洗4次，烘干。加入200 μL脫色劑，測定OD600 nm。以OD600 nm表示生物膜的生成量，以MRS與PA共培養的OD600 nm為陽性對照，并按式(3)計算細胞膜抑制率。

(3)

式中：

BFI——細胞膜抑制率，%；

A1——各種LAB與PA共培養時所測的OD600 nm；

A2——MRS與PA共培養時所測的OD600 nm。

1.8 數據分析

采用SPSS 20單因素方差分析進行差異性分析(P<0.05)，并使用GraphPad Primer 8.5軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 LAB抑菌能力

由表1和圖1可知，LGchen、S-5-6和L1 3株LAB的抑菌圈直徑分別為22.27，20.20，20.13 mm，顯著高于其他9種LAB的，N34的抑菌圈直徑最小，為12.33 mm，說明LAB對PA的抑菌效果具有菌株特異性。試驗中MRS-pH 4.0作為參照也有一定的抑菌效果，說明酸對PA生長有一定的抑制效果，但篩選的LAB的抑制效果強于MRS抑制效果，推測LAB的抗菌作用除受酸影響外，還可能與LAB的其他代謝物質有關，如過氧化氫、乙酸、乳酸及其他有機酸和細菌素等物質均有抑菌作用。劉君等[21]從魚、蝦腸道分離得到的戊糖片球菌對美人魚發光桿菌、大腸桿菌、溶藻弧菌、銅綠假單胞菌、創傷弧菌、副溶血弧菌等有不同程度的抑制作用。朱英蓮等[22]從發酵食品中分離出的6株LAB，其中3株有較好的抑制假單胞菌效果，產生的LAB素具有很好的耐熱性，在酸性條件下表現出良好的抑菌效果。LAB上清液對PA的生長也有明顯的抑制效果，說明LAB的代謝物具有抗菌作用，其具體抗菌物質需進一步研究。

圖1 LAB抑制PA生長

為研究LAB抑制PA感染的機制，選取4株抑菌高度敏感(LGchen、ZX5、L1和S-5-6)和2株抑菌中度敏感(N34和L23)的LAB進一步研究。經16S rRNA鑒定，N34和L23為植物乳桿菌，S-5-6和ZX5L為唾液乳桿菌，LGchen和L1分別為格氏乳桿菌和戊糖片球菌。

2.2 LAB信號分子AI-2的表達

LAB群體感應信號分子AI-2具有保守性，利用指示菌BB170識別LAB產生的AI-2信號分子，LAB可誘導BB170熒光酶基因的表達，從而產生發光反應。依據文獻[23]報道，LAB的AI-2表達最高值出現在穩定期初期或對數期末期，故采用培養18 h的LAB上清液進行測定。由圖2可知，S-5-6、LGchen和ZX5產生信號分子AI-2的能力較強，而L23表達AI-2的能力較弱。結合表1 分析，推測LAB信號分子AI-2的表達可能與LAB的抑菌能力相關。AI-2作為LAB種間交流信號分子，受其QS系統的調控，影響LAB的多項重要生理功能。邵長林[24]發現糞腸球菌 V583在培養過程中孵育過量的信號分子 AI-2會降低其翻譯、代謝、能量產生等15個相關蛋白的表達量，并促進生物膜的形成。楊杰[25]在培養植物乳桿菌 KLDS1.0391 時添加外源信號分子AI-2，發現菌體細菌素產量增加，并且不同添加量對細菌素的促進作用不同。宋剛等[26]研究發現，菌體釋放的自誘導分子AI-2或者共培養環境中的某些特定菌株，能夠激發LAB的群體感應系統，而LAB細菌素的產生受群體感應系統的調控，其合成量會提高，進而使得LAB對PA的抑菌能力提高。由此推測，LAB的AI-2表達能力會促進其抗菌能力，LAB的AI-2表達量高可能會增強其抑制PA的生長能力。

表1 LAB上清液對PA的抑菌效果?

字母不同表示差異性顯著(P<0.05)

2.3 LAB上清液與PA共培養信號分子AI-2的表達

由圖3可知，共培養物上清液的相對熒光強度有顯著差異性(P<0.05)，其中LGchen和L1對共培養的AI-2表達有明顯的抑制作用，ZX5與S-5-6對共培養的AI-2表達影響不大，而N34和L23上調了共培養的AI-2表達。

字母不同表示差異性顯著(P<0.05)

2.4 LAB對PYO表達的影響

由圖4可知，6株LAB中LGchen、S-5-6和L23抑制綠膿菌素表達的效果顯著(P<0.05)，而菌株N34、L1上調了PA綠膿菌素的表達，ZX5對PA綠膿菌素的表達影響不大。PYO是PA一種重要的毒力因子，與PA的致病性和感染性都密切相關[27]。PYO是有活性的次級代謝物，可無阻礙穿透生物膜、打斷呼吸鏈、產生大量的氧自由基和過氧化氫等導致細胞死亡[28]。抑制PYO的表達，在一定程度上可以抑制PA的生長，從而降低PA的毒性，抑制其感染。唐云鵬等[29]研究表明，不同濃度PYO對PA生長具有一定的促進作用。

字母不同表示差異性顯著(P<0.05)

2.5 LAB對PA生物膜形成的影響

PA生物膜的形成與其耐藥性產生有密切關系，生物膜可以阻止PA與抗菌藥物直接接觸，從而提高PA對抗菌藥物的耐藥性[30]。因此，去除病原菌的生物膜來抑制病原菌的生長與定植是一個非常好的防治病原菌感染的策略。由圖5可知，6株LAB均能抑制PA的生物膜形成，但抑制率存在差異，其中，LGchen和S-5-6對PA生物膜形成的抑制率較好，N34的抑制效果較差；而ZX5、L1和L23的抑制效果相差不大，說明LAB可以通過抑制PA生物膜形成達到抗菌的目的。Srikanjana等[31]研究表明，LAB具有拮抗李斯特菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的作用，是因為LAB將其他致病菌的細胞膜破壞，從而使致病細胞萎縮或裂開從而達到抗菌作用。

字母不同表示差異性顯著(P<0.05)。

2.6 LAB拮抗PA的相關性分析

由表2可知，LAB的抑菌能力與LAB抑制PA生物膜形成能力及LAB的AI-2表達量呈正相關，說明LAB抑制能力越強，其抑制PA生物膜形成的能力越強，同時，LAB 的AI-2表達影響LAB抑菌能力。LAB抑菌能力與共培養物上清液AI-2表達量呈負相關，說明LAB的抑菌能力越強，PA的AI-2表達能力越弱。LAB的AI-2表達與共培養物上清液AI-2表達呈負相關，說明LAB表達AI-2能力越強，其抑制PA的AI-2表達能力越強。綜上，LAB的抑菌性與其AI-2的表達、抑制PA生物膜形成及抑制PA的AI-2表達有關，但與PYO的表達無顯著相關性。

表2 皮爾森相關性分析

3 結論

試驗篩選的植物乳桿菌N34和L23，唾液乳桿菌S-5-6和ZX5，格氏乳桿菌LGchen和戊糖片球菌L1可以拮抗銅綠假單胞菌感染，其抗菌機制與乳酸菌抑制銅綠假單胞菌生長，抑制銅綠假單胞菌生物膜形成，乳酸菌自身AI-2表達量以及抑制銅綠假單胞菌的AI-2表達量有關。其中，格氏乳桿菌LGchen和唾液乳桿菌S-5-6的整體抗菌效果比較顯著，具有潛在商業應用的價值，后續將從代謝組學和轉錄組學進一步研究拮抗機制。

莫婷婷、張鳳霞、陳政良、陳小珍等人參與該研究的試驗數據測定，在此表示感謝！