microRNA-574-3p 抑制結腸癌細胞增殖的機制研究

劉振方,孟祥彩,武 玉,劉曉飛,米永鵬

(1.石家莊市中醫院普外科,石家莊 050051;2.秦皇島市第一醫院普外科,河北秦皇島 066000)

結腸癌是常見的消化道系統惡性腫瘤,嚴重威脅著患者的身心健康。 國際癌癥研究機構發布的《全球癌癥報告》數據顯示,2018 年結腸癌發病率全球第三,而死亡率高居第二[1]。 在我國,結腸癌的發病率呈逐年上升趨勢并趨于年輕化[2]。 因此,如何有效預防和治療結腸癌是臨床需要解決的迫切問題。 目前,結腸癌的治療仍以傳統手術、化學治療和放射治療為主[3]。 隨著醫藥產業的發展,新興的生物治療也逐漸應用于臨床。 但仍有部分結腸癌患者治療效果不佳。

微小RNA(microRNA,miRNA)是一類高度保守的功能性非編碼RNA。 miRNA 在細胞分化、組織形成及個體發育中發揮重要作用[4]。 同時,miRNA 也與眾多疾病密切相關,如在腫瘤[5]、糖尿病[6]、阿爾茨海默癥等[7]。 miR-574-3p 是 miRNA 家族中的一員,研究顯示,miR-574-3p 參與胃癌[8]、乳腺癌[9]及肝癌[10]的惡性進展。 最近的研究報道,miR-574-3p可靶向抑制結腸癌SW480 和HT29 細胞周期蛋白D2 表達,從而抑制細胞生長和遷移[11]。 提示,miR-574-3p 可能影響結腸癌細胞周期進程。 但 miR-574-3p 在結腸癌中的作用還不是十分清楚,有待于進一步研究。 本研究以結腸癌細胞HCT116 為研究對象,通過轉染miR-574-3p mimic 外源性過表達miR-574-3p 水平,觀察后者對細胞增殖的影響,并對相關作用機制進行探討。

1 材料和方法

1.1 細胞

人結腸癌細胞HCT116,購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心。

1.2 主要試劑與儀器

RPMI 1640 培養基(批號:8120357)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(批號:2132094P)和磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer solution,PBS)(批號:AE29561133),購自美國 Gibco 公司;CCK-8 試劑盒(批號:D03062005),購自美國 MedChemExpress 公司;細胞周期染色分析試劑盒(批號:20-15183),購自美國Abbkine 公司;miR-574-3p mimic 轉染試劑盒(批號:20191225),購自上海艾博思公司;RNAiso for Small RNA 試劑盒(批號:9753A)、PrimeScriptTMRT reagent Kit(批號:AK4102)和Mir-X miRNA qRTPCR TB Green?Kit(批號:638314) 購自大連TaKaRa 公司;細胞裂解液(批號:20191029)和結晶紫染色液(批號:20191025)購自北京索萊寶公司;CyclinA1 抗體(批號:9)、CDK2 抗體(批號:8)、PCNA 抗體(批號:3)、Cdc25A 抗體(批號:12)及P53 抗體(批號:8)及 GAPDH 抗體(批號:21),購自美國 Cell Signaling Technology 公司;羊抗兔 IgGHRP 抗體(批號:abs132004-06),購自上海愛必信公司。

Multiskan Sky 全波長酶標儀和QuantStudio 3 型實時熒光定量PCR 系統,美國Thermo Fisher 公司產品;TS100 倒置顯微鏡,日本尼康公司產品;Gel Doc XR+凝膠成像系統、電泳儀、轉膜槽及轉印夾,美國Bio-Rad 產品;Accuri C6 Plus 流式細胞儀,美國BD公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養

HCT116 細胞以 RPMI 1640 培養基(含 10%FBS 和1%青鏈霉素)置于 37℃、5% CO2、95%空氣的細胞培養箱中培養。

1.3.2 轉染miR-574-3p mimic 以上調細胞 miR-574-3p 表達

分組:細胞轉染miR-574-3p mimic 和陰性對照分別作為miR-574-3p mimic 組和陰性對照組,同時以正常HCT116 細胞作為空白對照組。 轉染:將對數期細胞以每孔3×105個接種于6 孔板中,培養過夜。 分別向含有2 ng miR-574-3p mimic 和陰性對照的管中加入1 mL RNase-free 水配制成母液。 各取兩種母液 2 μL 加入 98 μL 無血清 RPMI 1640 培養基中。 同時,將 2 μL Lipofectamine 加入 98 μL 無血清RPMI 1640 培養基中。 靜置5 min 后將上述兩種稀釋液混合以形成復合物,室溫保溫20 min。 取出細胞,棄去舊培養基,加入1 mL 無血清RPMI 1640培養基。 將兩種復合物分別加入細胞中,將細胞置于培養箱中繼續培養24 h。 以RT-qPCR 檢測細胞miR-574-3p 表達水平。

1.3.3 RT-qPCR 檢測細胞miR-574-3p 表達水平

收集miR-574-3p mimic 組、陰性對照組及空白對照組細胞,采用RNAiso for Small RNA 試劑盒提取細胞總RNA,檢測總RNA 濃度并將各組濃度調整一致。 各取 1 μg RNA 以 PrimeScriptTMRT reagent Kit 反轉錄為 cDNA,將 cDNA 稀釋備用。 同時,將miR-574-3p 和內參U6 的特異性引物稀釋備用。 利用 Mir-X miRNA qRT-PCR TB Green ? Kit 在QuantStudio 3 型實時熒光定量PCR 系統中進行擴增,每組設置 3 個重復孔。 2-△△CT法計算 miR-574-3p 的相對表達水平。

1.3.4 CCK-8 法檢測細胞增殖活力

取對數期miR-574-3p mimic 組、陰性對照組及空白對照組細胞以每孔9×103個/孔接種于96 孔板中,分別培養 12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h 進行檢測。 檢測時每孔加入10 μL CCK-8 溶液,培養箱中孵育4 h。 使用酶標儀測定 450 nm 光的吸光度值。

1.3.5 平板克隆實驗檢測細胞克隆形成能力

將對數期miR-574-3p mimic 組、陰性對照組及空白對照組細胞以每孔300 個接種于6 孔板中,細胞置于培養箱中培養10 d。 細胞以PBS 洗去培養基,每孔加入5%多聚甲醛溶液固定10 min。 PBS 洗去多聚甲醛,各加入結晶紫染色液1 mL,染色10 min。 清水洗去染色液,用相機拍照并進行統計。

1.3.6 流式細胞術檢測細胞周期

miR-574-3p mimic 組、陰性對照組及空白對照組細胞生長至對數期時以PBS 洗一遍,1000 r/min離心5 min 收集細胞,用預冷的75%乙醇對細胞進行固定。 細胞以 2000 r/min 離心 5 min,加入 400 μL 溴化乙錠(PI,50 μL/mL)和 100 μL RNase A(100 μg/mL ),4℃避光孵育 30 min。 以 Accuri C6 Plus 流式細胞儀上機檢測并分析細胞周期。

1.3.7 蛋白印跡檢測各組CyclinE 蛋白表達變化

miR-574-3p mimic 組、陰性對照組及空白對照組細胞生長至對數期時以PBS 洗一遍,用總蛋白提取試劑RIPA 細胞裂解液(含蛋白酶抑制劑)冰上裂解細胞10 min。 蛋白刮刀刮下細胞并收集于1.5 mL EP 管中,12000 r/min 離心20 min,吸取上清液至新的EP 管備用。 用BCA 蛋白定量試劑盒對各上清進行定量。 制備 30 μg/10 μL 的蛋白樣品,100℃變性5 min。 進行SDS-PAGE 電泳分離蛋白,并將蛋白轉印至PVDF 膜上,5%的脫脂牛奶封閉PVDF 膜4 h,用 CyclinA1(1 ∶1000)、CDK2(1 ∶2000)、PCNA(1∶1000)、Cdc25A(1 ∶1000)、P53(1 ∶2000)及 GAPDH(1 ∶1000)抗體于 4℃ 孵育過夜。 TBST 洗 PVDF 膜 3次,羊抗兔 IgG-HRP 抗體室溫孵育 1 h,PBS 洗PVDF 膜3 次,以 ECL 化學發光液對 PVDF 膜進行顯色,Gel Doc XR+凝膠成像系統進行顯影,讀取相應蛋白條帶灰度值。

1.4 統計學方法

以SPSS 15.0 軟件進行統計學分析,所有數據經正態性檢驗符合正態分布,以平均數±標準差()表示。 多組間數據比較采用單因素方差分析,事后兩兩多重比較以LSD-t檢驗分析。P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 轉染 miR-574-3p mimic 增強 HT-29 細胞miR-574-3p 表達

RT-qPCR 結果顯示,空白對照組、陰性對照組、miR-574-3p mimic 組 miR-574-3p 表達水平分別為(0.12±0.01)%、(0.13±0.01)%及(1.53±0.14)%,空白對照組與陰性對照組比較無明差異,與陰性對照組相比,miR-574-3p mimic 組miR-574-3p 表達明顯上調(P<0.01)。 見圖 1。

圖1 各組細胞miR-574-3p 表達變化(n=6)Note. Compared with the negative group, **P<0.01.Figure 1 Changes of miR-574-3p expression in each group

2.2 轉染 miR-574-3p mimic 抑制 HT-29 細胞增殖

CCK-8 結果顯示,12~72 h,空白對照組和陰性對照組細胞生長曲線相類似,而miR-574-3p mimic組細胞生長較為緩慢。 與陰性對照組相比,miR-574-3p mimic 組細胞在36~72 h 細胞活力均明顯降低(P<0.01)。 見圖 2。

圖2 各組細胞12~72 h 生長曲線(n=3)Note. Compared with negtive group, **P<0.01.Figure 2 12~72 h growth curve of cells in each group

2.3 轉染 miR-574-3p mimic 抑制 HT-29 細胞克隆形成

平板克隆實驗結果顯示,空白對照組、陰性對照組、miR-574-3p mimic 組細胞克隆形成率分別為100%、(102.60±9.60)%及(35.65±3.35)%。 空白對照組與陰性對照組比較無明差異,與陰性對照組相比,miR-574-3p mimic 組細胞克隆形成率顯著降低(P<0.01)。 見圖 3。

圖3 各組細胞克隆形成能力比較(n=3)Note. Compared with the negative group,**P<0.01.Figure 3 Comparison of cell clone formation ability in each group

2.4 轉染 miR-574-3p mimic 誘導 S 期 HT-29 細胞比例增加

流式細胞儀檢測結果顯示,空白對照組、陰性對照組、miR-574-3p mimic 組S 期細胞比例分別為(13.86 ± 2.65)%、 (15.12 ± 2.88)% 及 (35.36 ±4.50)%。 空白對照組與陰性對照組比較無明差異,與陰性對照組相比,miR-574-3p mimic 組S 期細胞比例顯著增加(P<0.01)。 見圖4。

圖4 各組細胞周期變化(n=3)Figure 4 Cell cycle changes in each group

2.5 轉染miR-574-3p mimic 誘導S 期相關蛋白表達變化

Western blot 結果顯示,空白對照組、陰性對照組及miR-574-3p mimic 組細胞CyclinA1 蛋白表達為100%、(96.32±7.80)%及(35.36±4.50)%,CDK2 蛋白 表達 為 100%、 (103.90 ± 8.92)% 及(33.30±3.56)%,PCNA 蛋白表達為100%、(105.25±9.85)%及(18.98±1.60)%,Cdc25A 蛋白表達為100 %、(100.80±8.65)%及(35.66±3.28)%,P53蛋白表達分別為100%、(97.68±9.28)%及(563.50±36.67)%。 空白對照組與陰性對照組比較各蛋白表達無明顯差異,與陰性對照組相比,miR-574-3p mimic 組 CyclinA1、CDK2、PCNA、Cdc25A 蛋白表達顯著下調(P<0.01),P53 蛋白表達明顯上調(P<0.01)。 見圖 5。

圖5 各組細胞S 期相關蛋白表達變化(n=3)Note. A, Blank group. B, Negative group. C, miR-574-3p mimic group. Compared with the negative group,**P<0.01.Figure 5 Changes in the expression of S-phase related proteins in each group

3 討論

miR-574-3p 作為miRNA 的一種,在包括腫瘤在內的多疾病中發揮一定作用[12-13]。 miR-574-3p 已被證實涉及胃癌、乳腺癌及肝癌等多種腫瘤細胞的惡性生物學行為[8-10]。 研究顯示,miR-574-3p 可通過靶向FAM3C 和MAPK1 抑制食道癌的增殖和侵襲[13]。 還有研究通過轉染 miR-574-3p mimic 或miR-574-3p inhibitor 調控 miR-574-3p 表達發現,miR-574-3p 能抑制MMP3 表達從而在卵巢癌中發揮抑癌作用[14]。 Yang 等[15]同樣通過轉染miR-574-3p mimic 或 miR-574-3p inhibitor 發現,miR-574-3p能通過靶向IL6/JAK/STAT3 途徑誘導慢性髓樣白血病細胞增殖抑制和凋亡。 這些提示,miR-574-3p在惡性腫瘤中可能發揮抑癌作用。 結腸癌相關報道顯示,miR-574-3p 通過靶向抑制結腸癌細胞周期蛋白D2 表達而抑制細胞生長和遷移[11]。 但miR-574-3p 在結腸癌中的作用還不是十分清楚,有待于更多研究探討。 本研究通過轉染化學合成的miR-574-3p mimic 成功誘導HCT116 細胞過表達 miR-574-3p。 進一步研究顯示,miR-574-3p mimic 能明顯誘導HCT116 細胞活力和克隆形成能力降低。 提示,miR-574-3p 可抑制結腸癌細胞HCT116 增殖,這與研究報道[11]結果相類似。 但miR-574-3p 抑制結HCT116 細胞增殖的信號機制還不完全清楚。

細胞周期是細胞基本的生命活動過程,可分為分裂期和分裂間期,分裂間期又分為G1 期、S 期、G2 期,細胞生命活動的大部分時間是在分裂間期度過的[16-17]。 一般來說,周期進程的速度與細胞增殖密切相關。 細胞周期的有序進行依賴于周期調控系統的嚴密調控。 當這種調控系統的某個環節受到影響后,細胞可能停留在細胞周期的某一期而不能進入下一周期,這種現象被稱為細胞周期阻滯[16-17]。 本研究顯示,HCT116 細胞轉染 miR-574-3p mimic 后S 期細胞比例明顯增加。 結合增殖實驗結果提示,miR-574-3p 可誘導HCT116 細胞 S 期阻滯。 研究顯示,人參皂苷Rg5 通過降低Cyclin A1、CDK2、PCNA 蛋白表達和升高P21 蛋白表達,從而誘導胃癌MKN-45 細胞發生S 期阻滯[18]。 另有研究顯示,亞砷酸鈉可通過上調SH-SY5Y 細胞p53 蛋白表達和下調CDC25A、CyclinA 及CDK2 蛋白誘導SH-SY5Y 細胞 S 期阻滯,從而抑制細胞生長[19]。 提示,CyclinA1、CDK2、PCNA、Cdc25A 及 P53 蛋白參與細胞 S 期調控。 為了探討 miR-574-3p 影響HCT116 細胞S 期阻滯的作用機制,本研究對上述蛋白進行了觀察。 結果顯示,HCT116 細胞轉染miR-574-3p mimic 后 CyclinA1、 CDK2、 PCNA、Cdc25A 蛋白表達顯著下調,P53 蛋白表達明顯上調。 提示,miR-574-3p 可能通過誘導 CyclinA1、CDK2、PCNA、Cdc25A 蛋白表達顯著下調,及 P53 蛋白表達上調,而誘導HCT116 細胞S 期阻滯。 而前文中miR-574-3p 抑制HCT116 細胞增殖,可能與阻滯細胞于S 期而不能進入G2 期有關。 但本研究目前只通過轉染miR-574-3p mimic 對結腸癌中miR-574-3p 的作用進行了研究,后續本研究還會以miR-574-3p inhibitor 進行進一步驗證。

近年來,核酸類藥物逐漸成為生物醫藥發展的前沿領域,與此同時作為功能性RNA 的miRNA 已經逐漸成為研究熱點。 本研究發現,miR-574-3p 可抑制結腸癌細胞HCT116 增殖,而該作用可能與下調 CyclinA1、CDK2、PCNA、Cdc25A 蛋白表達,及上調P53 蛋白表達,最終誘導細胞S 期阻滯有關。 因此,阻遏miR-574-3p 及其下游信號靶點可能是結腸癌治療的潛在方法。 本研究為臨床治療結腸癌提供了基礎理論支持,但在結腸癌中miR-574-3p 的功能作用還未完全明了,有待于進一步研究。