皮膚腐蝕和皮膚刺激替代試驗的發展及其在化學品危險性分類的應用

潘敘恩,盧章順,楊 光,鐘 岸,黃志鵬,何志榮

(廣東省科學院測試分析研究所(中國廣州分析測試中心),廣東省化學危害應急檢測技術重點實驗室,廣東省分析測試技術公共實驗室,廣州 510070)

近現代科學技術高速發展,目前全球已公布的物質已超過了1.5 億種[1],化學品的廣泛應用一方面改善了人們的生活,同時也提高了人們接觸化學品帶來的安全風險。 皮膚腐蝕性和刺激性是化學品基于聯合國GHS 分類的一種重要的潛在危險特性,準確評估和分類化學品對皮膚的腐蝕和刺激潛力,對加強化學品安全管理,預防和減少化學品事故,具有非常重要的意義。

長期以來,研究人員主要利用動物試驗對該課題進行研究,Draize 等[2]建立了利用白化兔評估化妝品對皮膚刺激潛力的方法,該方法逐步發展并在化學品皮膚腐蝕性和刺激性評估中得到廣泛的應用,后來被經濟合作與發展組織(OECD)采用為試驗準則404(TG404),成為GHS 皮膚腐蝕性和刺激性的分類依據。

隨著人類認知水平的提高和現代倫理學的發展,動物福利問題得到了越來越多的重視,作為傳統的動物試驗,Draize 試驗備受質疑和爭議。 1959年,動物學家Russell 和微生物學家Burch 共同發表了《人道實驗技術原則》(The Principles of Humane Experimental Technique),系統性地提出了“3R”(Replacement, Reduction and Reduction)的概念和準則,促使動物試驗的開展更符合人道主義精神[3]。“3R”的提出為實驗動物替代技術的研究確立了理論基礎,替代試驗的研究和應用逐漸成為化學品皮膚腐蝕/刺激潛力評估和分類的主要發展方向。

1 替代試驗的發展背景

為貫徹3R 原則,各國政府和國際組織進行了大量的工作:一方面,先后將3R 原則引入了實驗動物相關的法律法規以改善實驗動物的待遇,如中國《關于善待實驗動物的指導性意見》、歐盟《關于保護用于科研目的的動物的指令》、美國《美國政府關于在試驗、研究和訓練中使用和照顧脊椎動物的原則》、英國《動物(科學程序)法案》等[4]。 另一方面,為減少科研活動對動物體內試驗的依賴,資助了大批的研究機構、組織和研究項目以支持替代方法的研究,并成立了替代方法驗證中心組織系統性的方法驗證,如歐盟成立的歐洲替代方法驗證中心(ECVAM;后更名為替代動物實驗歐盟聯合參考實驗室EURL ECVAM)和美國的替代方法驗證跨部門協調委員會(ICCVAM)等。 隨著歐盟和美國、加拿大、日本等國簽署了替代方法國際合作協議( International Cooperation on Alternative Test Methods,ICATM),實驗動物替代技術進入了快速發展的階段。

實驗動物替代技術的進步,使立法禁止動物體內試驗得以成為可能。 在歐盟,有許多法規要求使用替代方法來代替體內試驗進行毒理學測試。 歐盟《化妝品法規》[5]禁止了2004 年以來的化妝品成品和2009 年以來的化妝品成分進行動物體內試驗,并自2013 年起禁止銷售含有經動物體內試驗成分的化妝品產品。 此外,歐盟《關于化學品注冊、評估、許可和限制的法規》(REACH 法規)[6-7]要求OECD 成員國對化學品的皮膚腐蝕和刺激性評估需利用替代方法進行體外試驗,除非該受試化學品不在替代方法適用的范圍內或替代方法無法對受試化學品作出準確的分類和風險評估。 歐盟《物質和混合物的分類、標簽和包裝法規》(EU CLP)[8-9]與REACH 法規相輔相成,在歐盟范圍內執行聯合國GHS 制度關于化學品分類和標簽的規定,該法規在皮膚腐蝕和刺激性分層評估中使用了證據權重(weight-of-evidence,WoE)方法,并鼓勵利用來自替代方法的數據。 最后,歐盟《關于保護用于科研目的的動物的指令》[10]規定“在不妨礙禁止某些試驗方法的成員國法律的前提下,如利用其它試驗方法或策略可以得到所需的結果時,成員國不得利用活體動物進行試驗”。 歐盟的立法對全球各國的法規也產生了巨大的影響,以色列、挪威、印度、新西蘭、澳大利亞、瑞士等國也先后立法禁止了化妝品產品進行動物體內試驗,全球目前已有超過30 個國家和地區實施了關于動物體內試驗的相關禁令。

2 分類標準對替代試驗的認可

聯合國GHS 的分類制度是目前世界范圍內最具普適性的化學品分類制度,對皮膚腐蝕性和刺激性化學品進行了明確的定義和分類(見表1)[11],源于OECD 統一分類和標簽工作組(OECD Task Force on Harmonization of Classification and Labelling,Task Force on HCL)對健康危害的分類標準。

表1 聯合國GHS 分類制度關于皮膚腐蝕性/刺激性的定義和分類Table 1 Categories and definition of skin corrosion/irritation of UN GHS

在較早版本的GHS 中,針對化學品的皮膚腐蝕和皮膚刺激的定義和分類仍基于OECD TG 404 的動物試驗。 得益于各國政府和科研工作者的努力,越來越多的體外方法被提出和驗證成為OECD 的試驗準則,用于替代 TG 404 的動物試驗。 目前經OECD 認可的替代試驗方法涵蓋了離體組織或器官、三維重組人類細胞組織和人造生物皮膚等模型(見表2),已能基本滿足聯合國GHS 的分類和評估需要。 在2019 年修訂的第八版GHS 中,這些替代試驗方法得到了進一步的認可被正式列為分類標準,用于皮膚腐蝕(類別1)、皮膚刺激(類別2)的識別。

表2 OECD 關于皮膚腐蝕性和刺激性替代試驗方法的驗證和認可情況Table 2 Validation and acceptance of OECD on the alternative testing methods of skin corrosion and irritation

3 皮膚腐蝕和刺激的試驗和評估綜合方法

在GHS 第八修訂版中,除了對體外試驗方法的進一步認可外,還引入了新的分類和評估策略——皮膚腐蝕和刺激IATA。 該策略源于OECD 指南GD 203,其建立的目的是為了適應替代方法發展的新形勢,滿足3R 原則和保障分類評估準確性的要求,取代原來 OECD TG404 補充文件中的測試和評估策略。

皮膚腐蝕和刺激IATA 主要分為3 個部分:(1)現有的信息、理化性質和非實驗方法;(2)證據權重評估;(3)補充實驗。 根據數據和信息的來源及功能,該評估策略的信息源被分為8 個模塊,這些模塊可分別應用于策略中的一個或多個部分(見表 3)[12]。 OECD GD203 指出,該評估策略的目標是在確保人身安全的前提下盡可能減少對實驗動物的使用,提出在分類和評估的過程中,應最大程度運用現有的數據合理安排證據權重評估,只有在無法獲得準確結果時再利用試驗進行分類。

表3 皮膚腐蝕性和刺激性IATA 的組成Table 3 Composition of the IATA for skin corrosion and irritation

4 替代試驗在皮膚腐蝕和刺激IATA 中的應用

替代試驗在皮膚腐蝕和刺激IATA 中的應用主要體現在兩個方面:首先,作為IATA 第一部分現有皮膚腐蝕和刺激屬數據的重要組成部分,基于文獻和資料所得的替代試驗數據可獨立用于WoE 評估或結合人類數據和動物試驗數據等其他模塊的信息用于綜合WoE 評估。 其次,皮膚腐蝕和刺激替代試驗也是該分類評估策略第三部分補充實驗的重要組成部分,研究人員可對WoE 評估無法獲得確證結果的化學品執行自上而下或自下而上的試驗策略,利用體外試驗方法(必要時結合動物試驗)進行最終的分類和評估。

在應用這些替代試驗方法之前必須明確,目前已經得到認可的方法都存在著一定的局限性,至今仍然沒有任何一種單一的體外試驗方法可以覆蓋全部分類范圍。 充分理解每種方法的原理、適用范圍和局限性,對于研究人員選擇合適的方法非常重要,是有效執行皮膚腐蝕和刺激IATA 評估策略的關鍵。

5 OECD 認可的皮膚腐蝕/刺激替代試驗方法及其適用性

5.1 經皮電阻試驗方法

TG430[13]體外皮膚腐蝕經皮電阻(transcutaneous electrical resistance,TER)試驗方法利用了離體的大鼠表皮組織對化學品的皮膚腐蝕性進行評估。 受試皮膚片取自安樂處死的28~30 d齡的大鼠。 實驗過程中,受試皮膚片安裝在測試系統中,把整個測試系統分隔為內外兩層。 受試物涂覆在受試皮膚片的表皮面,保持24 h。 通過測定受試皮膚片的經皮電阻,確定角質層的缺失程度和皮膚屏障功能的完整程度來識別受試物的腐蝕性。根據大量化學品的大鼠TER 測試結果,選取了5 kΩ 作為皮膚腐蝕性的判定閾值。 通常,無論對皮膚是否具有刺激性,對活體動物皮膚無腐蝕性的物質,其TER 值都不會低于該判定閾值。 該方法還增加了染色試驗,進一步對TER 測試陽性(包括TER接近5 kΩ 的結果)但無明顯損傷的皮膚片進行確認。

與其他已得到OECD 認可的替代試驗相比,TG430 利用的離體皮膚模型包含了提供主要屏障功能的角質層和表皮細胞層,以及皮脂腺、汗腺和毛囊等所有附屬器官,具有完整的皮膚組織結構,可更近似地模擬化學品在體內發生的經皮滲透和吸收。 但是,該方法只能劃分皮膚腐蝕(類別1)和非腐蝕性的樣品,適用于大量化學品腐蝕危險性的篩查,并不能進一步劃分皮膚腐蝕性子類別,也不能識別非腐蝕性的樣品是否具有刺激性。

5.2 重建人類表皮模型試驗方法

目前已驗證的利用體外重建人類表皮模型(reconstructed human epidermis test method,RhE)的皮膚腐蝕和刺激性試驗方法有 TG431[14]和TG439[15],其原理是假設腐蝕/刺激性化學物質能夠通過擴散或侵蝕作用滲透穿過角質層,對下層的細胞產生毒性作用。 該模型是利用組織工程學技術構建的多層、高度分化的三維表皮模型,包含了基底層、棘細胞層、顆粒層、角質層和脂質等與正常皮膚相似的結構。 由于TG431 和 TG439 的 RhE 模型沒有形成血管,因此選擇了以細胞活性作為測定終點對細胞和組織的損傷進行評估。

TG431 用于化學品的皮膚腐蝕性的評估,方法是將受試物局部作用在三維RhE 模型上,在特定作用時間后,利用3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑噻唑藍(MTT)還原法測量受試RhE 組織的細胞活性,然后通過與閾值的比較來識別和分類受試物腐蝕性。

TG439 用于評估化學品的皮膚刺激性,該方法進一步利用了RhE 模型的特點,在試驗過程中并不是在與受試物作用后立即測量RhE 組織的細胞活性,而是對經過沖洗的RhE 組織在新培養基中進行足夠長時間的培養之后才進行細胞活性的測量。這樣既可以使RhE 組織從較弱的細胞毒性作用中恢復,也有足夠的時間表達明確的細胞毒性作用。

與其他已獲得OECD 認可的替代方法相比,TG431 和 TG439 具有很多優勢。 首先,RhE 模型是由人源性的表皮角質細胞培養所得,與被模擬的人體皮膚組織不存在物種差異。 其次,RhE 組織可以通過培養恢復細胞活性,TG439 是目前唯一受OECD 認可的評估皮膚刺激性(類別2)的替代方法。 最后,RhE 試驗方法有很多可選用的商業化模型,TG431 和 TG439 分別于 2019 年和 2020 年進行了最新的修訂,目前最新版本的試驗準則中已得到驗證和認可的商業化模型已分別增至5 個和6 個(TG431: EpiSkinTM、 EpiDermTMSCT、 SkinEthicTMRHE、epiCS?、LabCyte EPI-MODEL24 SCT;TG439:EpiSkinTM( SM )、 EpiDermTMSIT ( EPI-200 )、SkinEthicTMRHE、 LabCyte EPI-MODEL24 SIT、epiCS?、Skin+?)。

需要注意的是有些化學品會在試驗過程中顯色或能與MTT 作用產生非特異的顏色反應,干擾細胞活力的測定結果,雖然通過設置非特異性顯色(NSCliving)和非特異性MTT 反應(NSMTT)對照組可對這些干擾進行排除,但是針對陰性對照NSCliving≥50%和/或NSMTT≥50%的結果應十分謹慎。 此外,TG431 和TG439 的分類能力仍存在著局限性,TG431 可用于識別化學品皮膚腐蝕性(類別1 及子類別1A 和1B/1C)和非腐蝕性,但無法進一步分辨子類別1B 和1C;TG439 可以區分皮膚腐蝕/刺激(類別1/2)和皮膚輕度刺激/非刺激(類別3/不劃類),但不能進一步對類別1 和類別2 進行識別,也無法分辨類別3 和不劃類,這些都是在利用這些試驗方法或其數據時必須注意的。

5.3 膜屏障試驗方法

在OECD 認可的對皮膚腐蝕性和刺激性的替代試驗方法中,TG435[16]膜屏障(membrane barrier)試驗方法是唯一一種完全基于人造的非生物皮膚模型(artificial non-viable skin model)的方法。 其測試系統由人造的高分子生物膜和化學檢測系統(chemical detection system, CDS)組成,原理是基于人造高分子生物膜與活體皮膚具有相似的腐蝕作用機制的假設,受試物局部作用于高分子生物膜表面,經過特定的作用時間,通過CDS(如pH 指示劑顏色改變、指示劑溶液其他特性改變等)檢測高分子生物膜的屏障功能是否受到破壞,受試物是否穿透了高分子生物膜,以此對受試物的腐蝕性進行識別和分類。

目前,TG435 的商業化模型只有Corrositex ?一種,可用于識別化學品皮膚腐蝕性(類別1)和非腐蝕性,基于Corrositex?的子分類標準可利用受試物對生物膜的穿透時間進一步劃分腐蝕性子類別1A、1B 和1C。 Corrositex?操作簡單,在評估酸、堿以及酸衍生物的皮膚腐蝕性時非常有效[17],但基于該CDS 的特點,不適用于評估pH 值4.5~8.5 及其他無法令CDS 指示劑發生顏色變化的化學品[18]。 雖然該方法無法分辨非腐蝕化學品的皮膚刺激性(類別2/3)和非腐蝕性(不劃類),但是在執行一些運輸相關法規要求的測試時特別適用,如美國交通運輸部的危險物質法規[19]就明確規定了針對TG430 或TG431 劃為腐蝕性的危險品,必須利用 TG435 或TG404 對結果進一步確定。

6 其他的皮膚腐蝕/刺激替代試驗方法

作為皮膚腐蝕和刺激IATA 模塊5a,這些暫未受OECD 認可的皮膚腐蝕和刺激性評估的體外模型和替代方法有許多,除了一些商業化的RhE 模型(KeraSkinTM、EpiKutis ?、EST1000 ?、StrataTest ?、Vitrolife-SkinTM、Phenion ?等)[20-23]、開源的 RhE 模型(OS-Rep[24-25]) 和其他類似的 RhE 模型(如HaCaT 表皮模型[26-27]、LHE 人類表皮模型[28]、基于手術獲得的人類皮膚的模型[29]、人類全厚皮膚模型[30]等),還包括了一些正在研究開發的新模型和新方法。

Groux 等[31]研究了RhE 模型響應皮膚刺激物而引起的基因表達變化,并根據基因表達水平開發了一種方法用于劃分刺激性(類別2)、輕度刺激性(類別3)和非刺激性(不劃類)。 Spiekstra 等[32]研究表明在RhE 模型中利用IL-1α,IL-1RA,IL-8 等生物標志物和MTT 不僅能識別受試物的腐蝕性和刺激性,還可以確定化學物質對皮膚的刺激能力。 除此以外還有許多應用了蛋白質組學和毒物基因組學技術,并非以細胞活力為測定終點的試驗方法[33-36]。

另外,Khammo 等[37]和 Muller 等[38]研究組還分別利用從胚胎大鼠背根節神經元提取的感覺神經元和人類誘導性多能干細胞(iPSC)構建了受神經支配的組織工程皮膚(TES)模型,可在體外試驗中模擬在體內由神經性炎癥造成的刺激和疼痛[39]。

最后,還有更多基于生物打印、器官芯片等新技術應用的新模型和新方法,如Wei 等[40]研究利用3D 生物打印技術構建的可有效應用于皮膚刺激研究的人類全厚皮膚模型,以及Jusoh 等[41]研究以臍靜脈內皮細胞(HUVEC)、人類真皮成纖維細胞(HDF)、角質形成細胞和微流控芯片構建的具有血管生成能力的皮膚芯片,還有Tavares 等[42]研究基于微生理系統構建的人類皮膚-肝雙器官集成芯片。

7 結論與展望

3R 原則提出以來,實驗動物福利的問題得到了更多的關注,實驗動物替代技術在科技和法規的雙重驅動下獲得了很大的發展,人們越來越重視利用體外模型和試驗方法代替動物試驗進行化學品安全性的研究。 近年來,在化學品皮膚腐蝕性和刺激性的研究方面,無論從替代試驗方法的開發還是分類評估試驗策略的創新都取得了很大的進步。 越來越多的體外模型和試驗方法通過了驗證;基于組學技術的應用研究,更多的測定終點被提出;得益于3D 生物打印、干細胞和生物芯片等技術的發展,構建更復雜的體外模型也成為了可能。 隨著科技的進步,更多的體外試驗方法和模型將被開發和應用。

中國與其他主要發達國家和地區相比,在動物試驗替代方法的開發和驗證等方面的工作起步稍晚,在管理和發展上還存在著一定的差距。 目前在實驗成本方面,替代試驗與動物試驗相比仍不具備優勢。 此外,在GHS 皮膚腐蝕性和刺激性分類的應用上,現有的替代試驗方法在適用條件和分類范圍等仍存在著局限。 皮膚腐蝕性和刺激性IATA 以3R原則為指導,提出盡可能優先利用現有的數據進行證據權重評估,必要時再結合危險性分類需求合理地制定策略開展試驗。 該策略結合目前實驗動物替代技術的發展現狀,充分優化了皮膚腐蝕性和刺激性的分類試驗流程,最大程度地減少不必要的試驗和避免了對實驗動物的使用,正確利用這一策略對今后有效開展皮膚腐蝕性和刺激性分類評估工作具有非常重要的意義。