三陰性乳腺癌與非三陰性乳腺癌組織中PD-1、PD-L1、FOXP3 的差異表達及其臨床意義

賈秀鵬，蒙伶俐，李海莉，陳 潔，陳佳意

（寧波市臨床病理診斷中心，浙江 寧波 315000）

乳腺癌（breast cancer）是一種常見的惡性腫瘤[1-3]，是全球婦女癌癥相關死亡的第一大原因。目前，對于乳腺癌的發(fā)病機制仍知之甚少，主要是惡性腫瘤侵犯破壞乳腺正常組織并通過淋巴管、血道，引起局部或全身復發(fā)轉移。臨床常用的乳腺癌治療方法包括化學治療、內分泌治療、曲妥珠單抗靶向治療、免疫治療及放射治療等。三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是目前被公認的臨床治療效果最差，爭議最多的一種亞型[4]。程序性死亡分子-1（programmed death-1，PD-1）、程序性死亡分子配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）均為腫瘤免疫檢查點，在人類免疫調節(jié)途徑中起著重要作用[2]。研究表明[3]，PD-1/ PD-L1 在腫瘤組織中可通過傳遞抑制性信號，引起腫瘤特異性T 細胞無法活化，從而不能將腫瘤細胞殺死，最終可導致抗腫瘤免疫降低甚至失效。叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子（forkhead/winged helix transcription factor，F(xiàn)OXP3）被認為是調節(jié)性T 細胞獨立的標記物，可通過誘導體內調節(jié)性T 淋巴細胞發(fā)揮負性調節(jié)功能，最終誘導癌細胞的免疫逃逸[4]。目前，PD-1、PD-L1、FOXP3 已被報道在食管鱗狀細胞癌[5]、非小細胞肺癌[6]、肝癌、結腸癌等多種惡性腫瘤組織中存在高水平表達，并被證實與患者臨床病理特征密切相關，然而，其在乳腺癌中報道尚不多見，尤其在三陰性乳腺癌的相關研究者報道甚少。本研究通過測定70例三陰性乳腺癌，30例非三陰性乳腺癌患者組織中PD-1、PD-L1、調節(jié)性T 淋巴細胞FOXP3的表達情況，探討其與三陰性乳腺癌患者臨床病理特征間的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015 年1 月-2020 年1 月經(jīng)寧波市臨床病理診斷中心診斷的70例三陰性乳腺癌，30例非三陰性乳腺癌患者為研究對象。100例乳腺癌患者中組織學分級Ⅰ、Ⅱ級者35例、Ⅲ級者65例；淋巴血管侵犯者38例，有淋巴結轉移者31例。本研究經(jīng)中心倫理委員會批準，取得患者知情同意并簽署同意書。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準 ①年齡18～65歲；②經(jīng)手術切除治療；③術前未接受過放療、化療；④臨床資料完整。

1.2.2 排除標準 ①合并其他惡性腫瘤；②合并免疫系統(tǒng)疾病。

1.3 方法 采用免疫組化法測定組織中PD-1、PDL1、FOXP3 的表達。組織制成厚度為4 μm 的連續(xù)切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟至水，所有免疫組化均在Leica BOND-MAX 全自動免疫組織化學儀上操作。DAB顯色，以蘇木精輕度復染；分別以已知陽性扁桃體組織作為陽性對照、PBS 代替一抗作為陰性對照；其中鼠抗人PD-1、鼠抗人FOXP3、兔抗人CD3 單克隆抗體試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，兔抗人PD-L1 多克隆抗體（克隆號SP142）購自英國Abcam 公司。免疫組織化學結果均由2名高年資乳腺病理?？漆t(yī)師進行雙盲獨立閱片。ER/PR 判斷標準依據(jù)2020 年美國臨床腫瘤學會/美國病理醫(yī)師學院（ASCO/CAP）判斷標準[7]，ER 和PR 胞核陽性細胞≥1%判定為陽性。HER2 判讀標準依據(jù)2019 年中國乳腺癌HER2 檢測指南[8]，0～1＋表示陰性，3＋表示陽性，2＋則進行熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）檢測，如HER2 基因無擴增則為陰性。PD-L1 以細胞膜和/或細胞質出現(xiàn)棕黃至棕褐色為陽性。PD-L1 以陽性細胞數(shù)≥1%判為陽性，＜1%判為陰性[9]，分別評價腫瘤細胞及間質腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）中PD-L1的表達情況。PD-1 表達于間質TIL，以細胞核出現(xiàn)棕黃至棕褐色為陽性。以陽性細胞數(shù)≥5%判為陽性，＜5%判為陰性[9]，F(xiàn)OXP3 陽性判定標準：FOXP3陽性物為黃色或棕黃色顆粒，定位于調節(jié)性T 細胞的細胞核內[10]。

1.4 觀察指標 ①比較三陰性乳腺癌組織與非三陰性乳腺癌組織中PD-1、PD-L1、FOXP3 陽性表達情況；②比較不同年齡、腫瘤直徑、組織分化程度、淋巴血管侵犯情況、淋巴結轉移情況患者乳腺癌組織中腫瘤細胞及間質腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）PD-1、PD-L1、調節(jié)性T 淋巴細胞FOXP3 陽性表達率。

1.5 統(tǒng)計學處理 本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 統(tǒng)計分析軟件處理，計數(shù)資料以（%）表示，比較采用χ2分析；P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PD-1、PD-L1、FOXP3 表達情況比較 三陰性乳腺癌組織中腫瘤細胞及間質腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）中PD-1、PD-L1、調節(jié)性T 淋巴細胞FOXP3陽性表達率均高于非三陰性乳腺癌組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1、圖1。

圖1 免疫組化法測定PD-1、PD-L1、FOXP3 蛋白表達（×400）

表1 三陰性乳腺癌組織與非三陰性乳腺癌組織中PD-1、PD-L1、FOXP3 陽性率比較[n（%）]

2.2 三陰性乳腺癌組織中間質TIL PD-1 陽性表達率與患者臨床病理特征的關系 三陰性乳腺癌組織中間質TILPD-1 陽性表達率與患者年齡、腫瘤直徑比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；組織學分級為Ⅲ級、淋巴血管侵犯及淋巴結轉移患者三陰性乳腺癌組織中間質TILPD-1 陽性表達率分別高于組織學分級為Ⅰ、Ⅱ級、無淋巴血管侵犯及無淋巴結轉移患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 三陰性乳腺癌組織中間質TILPD-1 陽性表達率與患者臨床病理特征的關系[n（%）]

2.3 三陰性乳腺癌組織中PD-L1 陽性表達率與患者臨床病理特征的關系 三陰性乳腺癌組織中腫瘤細胞及間質TIL 中PD-L1 陽性表達率與患者年齡、腫瘤直徑比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；組織學分級為Ⅲ級、淋巴血管侵犯及淋巴結轉移患者三陰性乳腺癌組織腫瘤細胞及間質TIL 中PD-L1陽性表達率分別高于組織學分級為Ⅰ、Ⅱ級、無淋巴血管間隙侵犯及無淋巴結轉移患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 三陰性乳腺癌組織中PD-L1 陽性表達率與患者臨床病理特征的關系[n（%）]

2.4 三陰性乳腺癌組織中調節(jié)性T 細胞FOXP3 陽性表達率與患者臨床病理特征的關系 三陰性乳腺癌組織中調節(jié)性T 細胞FOXP3 陽性表達率與患者年齡、腫瘤直徑及有無淋巴結轉移比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；組織學分級為Ⅲ級、淋巴血管侵犯患者三陰性乳腺癌組織中調節(jié)性T 細胞FOXP3 陽性表達率分別高于組織學分級為Ⅰ、Ⅱ級、無淋巴血管侵犯患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表4。

表4 三陰性乳腺癌組織中FOXP3 陽性表達率與患者臨床病理特征的關系[n（%）]

3 討論

PD-L1 又稱為B7 同源體1（B7 homolog 1，B7-H1），是通過人類基因庫進行B7-1、B7-2 同源性分析時發(fā)現(xiàn)的。人PD-L1 基因定位于染色體9p24.2，cDNA 全長873bp[10，11]。PD-L1 mRNA 在許多組織中可以檢測到，在心臟、胎盤、肺臟和骨骼肌表達較高，在胸腺、肝臟、脾臟和腎臟呈低水平表達。免疫組織化學法研究表明PD-L1 蛋白的表達在正常組織中僅局限于巨噬系統(tǒng)來源的細胞，如肝臟的Kupffer 細胞，肺臟的巨噬細胞，扁桃體副皮質區(qū)的組織細胞等。而在人類肺癌、卵巢癌、結腸直腸癌、惡性腦腫瘤、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、腎細胞癌等許多腫瘤組織中都可檢測到PD-L1 的表達。有些不表達PD-L1的腫瘤細胞在IFN-γ 刺激后可誘導其表達。PD-1是PD-L1 的受體[12-14]。PD-1、PD-L1 均為腫瘤免疫檢查點，在人類免疫調節(jié)途徑中起著重要作用[2]。研究表明[3]，PD-1/PD-L1 在腫瘤組織中可通過傳遞抑制性信號，引起腫瘤特異性T 細胞無法活化，從而不能將腫瘤細胞殺死，最終可導致抗腫瘤免疫降低甚至失效。

PD-L1 在多種實體腫瘤組織中的異常高表達近年來引起廣泛的關注，并且在結腸癌、腎細胞癌、宮頸癌中的高表達與腫瘤的不良預后有關。隋啟海等[5]以食管鱗狀細胞癌患者為研究對象，發(fā)現(xiàn)癌組織與癌旁組織中PD-1、PD-L1 表達水平存在顯著差異，且PD-1、PD-L1 水平與腫瘤T分期相關；吳菡等[6]研究發(fā)現(xiàn)，非小細胞肺癌患者PD-1 及PD-L1的mRNA 和蛋白均存在高度表達，且表達水平與腫瘤直徑、腫瘤轉移密切相關。本研究應用免疫組織化學的方法檢測了PD-L1、PD-1分子在三陰性乳腺癌、非三陰性乳腺癌組織中的表達情況，分析與各臨床病理參數(shù)之間的相關性，發(fā)現(xiàn)三陰性乳腺癌癌組織中PD-1、PD-L1 陽性表達率顯著高于非三陰性乳腺癌組織（P＜0.05），且進一步分析發(fā)現(xiàn)PD-1、PD-L1 陽性表達率與患者高組織學級別、淋巴血管侵犯以及淋巴結轉移情況密切相關，與既往研究結論一致，提示PD-1/PD-L1 通路激活促進了腫瘤發(fā)生免疫逃逸，起到了免疫負調控的作用，其可能通過多種機制參與了腫瘤的進展。以PD-1/PD-L1 靶點為代表的腫瘤免疫治療為三陰性乳腺癌患者帶來了新的希望，其靶向藥可能會進入TNBC 患者的治療方案。

越來越多的研究表明，腫瘤微環(huán)境對腫瘤的發(fā)生和演進起著不容忽視的重要作用。機體組織正常狀態(tài)下少有免疫細胞浸潤，但是在發(fā)生腫瘤時卻出現(xiàn)大量的免疫細胞浸潤。腫瘤浸潤性淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocytes，TILs），雖然不能直接識別和殺傷腫瘤細胞，但其對抗體的生成以及腫瘤殺傷細胞的活化具有輔助、放大效應[15]。近年來研究發(fā)現(xiàn)[16，17]，除PD1 及其配體PD-L1 外，F(xiàn)OXP3 同樣能夠阻礙機體的免疫系統(tǒng)對腫瘤的監(jiān)視，為腫瘤細胞免疫逃逸提供有力環(huán)境，促進腫瘤的發(fā)展。Hou J 等[18]和蘇偉[19]以胃癌和結腸癌患者為研究對象，發(fā)現(xiàn)FOXP3 表達與腫瘤分期及分化程度相關。Zhang H等[20]研究顯示，宮頸癌組織中存在FOXP3 的高度表達，且其表達水平與患者高組織學級別顯著相關。Zhang L 等[21]研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌組織中FOXP3+Treg細胞的分布方式和數(shù)量不同，并且與乳腺癌患者的預后有關。本研究發(fā)現(xiàn)，三陰性乳腺癌組織中調節(jié)性T 淋巴細胞FOXP3 陽性表達率高于非三陰性乳腺癌組織（P＜0.05），且與高組織學級別、淋巴血管侵犯情況相關，與既往研究結論一致，由此推斷在乳腺局部微環(huán)境中，負性因子FOXP3 的免疫抑制作用增強，并且此種免疫負性調節(jié)作用是隨著腫瘤惡性分化程度的加重而加劇的。

綜上所述，三陰性乳腺癌患者癌組織中存在PD-1、PD-L1、調節(jié)性T 淋巴細胞FOXP3 的高表達，且其表達水平與乳腺癌患者高組織學級別、浸潤與轉移密切相關，當然，尚需大宗病例深入的研究來證實PD-1/PD-L1 作為TNBC 生物標志物的可行性，甚至制定出三陰性乳腺癌PD-1/PD-L1 檢測指南來篩選適合的患者進行腫瘤免疫治療。