口蹄疫O型、A型二價3B蛋白表位缺失滅活疫苗免疫安全性和抗體消長規律研究

徐小艷 陳昌海梁永曄王相子 陳培華開 妍 邱 冬

（1江蘇省動物疫病預防控制中心，江蘇南京 210036；2寶應縣畜牧獸醫站，江蘇揚州 225800）

口蹄疫是目前對養豬業危害較嚴重的一種傳染病。一直以來，我國對口蹄疫防控都實施強制免疫策略，選用口蹄疫滅活疫苗對豬只進行免疫預防。已發表的研究結果[1]表明，若口蹄疫疫苗中含有殘留的微量非結構蛋白，能誘導動物機體產生特異性抗體，特別是重復注射疫苗后尤為明顯。因此，使用口蹄疫傳統滅活疫苗對口蹄疫的診斷、檢疫存在很大的干擾作用，是阻礙我國口蹄疫凈化和建立口蹄疫無疫區的重要原因之一。本研究選用的口蹄疫O型、A型二價3B蛋白表位缺失滅活疫苗，因缺失了口蹄疫病毒非結構蛋白主要優勢表位3B基因，疫苗中不存在非結構蛋白優勢表位3B，免疫動物后，不產生口蹄疫非結構蛋白抗體，通過非結構蛋白抗體檢測，可有效區分自然感染和注射疫苗動物，可為口蹄疫的疫病凈化提供有效的技術手段。通過對口蹄疫O型、A型二價3B蛋白表位缺失滅活疫苗（O/rV-1株+A/rV-2株）免疫安全性和抗體消長規律的研究，評估其安全性和誘導產生的抗體水平，可為臨床應用口蹄疫疫苗提供新選擇，為口蹄疫疫病綜合防控和凈化提供技術保障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗豬

選取江蘇省揚州市某生豬養殖場45日齡仔豬50頭。豬群健康，生長良好，試驗前，所有仔豬均未免疫任何口蹄疫疫苗。

1.1.2 疫苗

口蹄疫O型、A型二價3B蛋白表位缺失滅活疫苗（O/rV-1株+A/rV-2株），中牧實業股份有限公司提供，批號1909001。

1.1.3 檢測試劑

豬口蹄疫病毒非結構蛋白合成肽ELISA抗體檢測試劑盒，購自中牧實業股份有限公司，批號ZM2019001；口蹄疫病毒A型抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒，購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所，批號20191202103-1；口蹄疫病毒O型抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒，購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所，批號202004011 01-2。

1.2 方法

1.2.1 免疫與樣品采集

⑴試驗分組。50頭仔豬隨機分為2組，分別為：一免組，25頭，只進行一次免疫；二免組：25頭，一免后31 d進行一次加強免疫（二免）。

⑵免疫劑量與途徑。免疫劑量為2 mL/頭，頸部肌肉注射。

⑶疫苗注射與樣品采集。一免前采血與一免：一免前進行第1次采血，隨機采集15頭豬血樣（覆蓋一免組和二免組）并分離血清，凍存。參考豬場口蹄疫疫苗的原有免疫程序，一免時間選定在45日齡，對一免組和二免組共50頭仔豬實施免疫。

一免后采樣：一免后29 d，隨機采集15頭豬血樣（覆蓋一免組和二免組）并分離血清，凍存；一免后61 d、95 d、123 d，分別對一免組試驗豬進行采樣，每次隨機采集15頭豬血樣并分離血清，凍存。

二免：二免組試驗豬在一免后31 d加強免疫1次。

二免后采樣：二免后30 d、64 d、92 d，分別對二免組試驗豬進行采樣，每次隨機采集15頭豬血樣并分離血清，凍存。

1.2.2 免疫安全性觀察

所有試驗豬每次免疫后就地觀察2 h，如無異常癥狀，則由畜主管理并繼續觀察，免疫后48 h內回訪1次。試驗期間，不定期到場觀察。

1.2.3 抗體檢測

⑴非結構蛋白抗體，采用豬口蹄疫病毒非結構蛋白合成肽ELISA抗體檢測試劑盒檢測口蹄疫非結構蛋白抗體，按照試劑盒說明書進行操作。

⑵結構蛋白抗體，采用口蹄疫病毒A型抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒檢測A型口蹄疫抗體，采用口蹄疫病毒O型抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒檢測O型口蹄疫抗體。按照試劑盒說明書進行操作，每塊酶標板檢測10份樣品，采用Log10（效價）表示定量檢測結果。

1.2.4 結果判定

口蹄疫非結構蛋白抗體：血清OD450nm值＜臨界值，判為陰性；血清OD450nm值≥臨界值，判為陽性。

A型口蹄疫抗體、O型口蹄疫抗體：血清Log10（效價）＜1.8，判為陰性；血清Log10（效價）≥1.8，判為陽性。

2 結果

2.1 免疫安全性試驗結果

觀察豬只精神狀態、采食量、糞便、尿液以及豬群的發病和死亡情況，試驗期間未發現豬只精神狀態、采食量、糞便、尿液等出現異常情況，試驗豬群未發病、死亡。

2.2 抗體檢測結果

試驗期間，不同時間點各組實際采集樣品數為14～16份/次，共采集并檢測豬血清130份，檢測結果見表1。

表1 試驗豬群抗體檢測結果

3 討論

3.1 免疫安全性

試驗豬群未發現異常情況，表明口蹄疫O型、A型二價3B蛋白表位缺失滅活疫苗（O/rV-1株+A/rV-2株）對仔豬群進行免疫是安全的。

3.2 非結構蛋白抗體

免疫前后，豬群口蹄疫非結構蛋白抗體檢測結果均為陰性，說明疫苗免疫后未產生非結構蛋白抗體，豬群也未感染口蹄疫病毒而產生感染抗體。因此，該疫苗的應用可以有效解決口蹄疫疫病監測和診斷中無法有效區分感染抗體和免疫抗體的難題，為該病的凈化工作提供技術手段，可以大大縮短凈化周期，提高凈化實效。

3.3 A型和O型口蹄疫抗體消長規律

從A型和O型口蹄疫抗體陽性率來看，免疫前，分別為7.14%和0；一免后29 d、61 d、95 d、123 d，二免后30 d、64 d、92 d，均為100%。從A型和O型口蹄疫抗體Log10（效價）均值來看，免疫前，該指標數值分別為0.86和0.75，低于判定陽性臨界值1.8；一免后29 d、61 d、95 d、123 d，二免后30 d、64 d、92 d，該數值均遠大于1.8。從A型和O型口蹄疫抗體Log10（效價）標準差來看，本研究中涉及的各個時間點，該指標數值均較小，說明個體之間抗體水平差異小，疫苗免疫整齊度高。

4 結論

用口蹄疫O型、A型二價3B蛋白表位缺失滅活疫苗對仔豬進行一次免疫，免疫后29 d，A型和O型口蹄疫抗體陽性率迅速上升至100%，且維持在高水平（100%）的時間可達4個月；進行二次免疫，二免后30天，A型和O型口蹄疫抗體陽性率為100%，且維持在高水平（100%）的時間約3個月，可為該病的綜合防控提供有效的疫苗產品。

該疫苗不僅可以免疫預防豬O型口蹄疫，還可以免疫預防豬A型口蹄疫，因而解決了生豬生產中存在的豬免疫牛羊口蹄疫滅活疫苗[2-5]的問題，為口蹄疫疫苗的科學合理使用提供了新選擇。