非洲豬瘟病毒檢測技術研究進展

劉 濤李永秀康亞男郭 禹劉朋朋柳 珊

（1河北農業大學動物醫學院，河北保定 071001；2瑞普 （保定）生物藥業有限公司，河北保定 071000；3河北科醫生物技術有限公司，河北保定 072750；4天津瑞普生物技術股份有限公司，天津 300308）

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染引起豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，該病臨床上以高熱、皮膚和內臟廣泛性出血、腹瀉、死亡為主要特征，其是目前已知的唯一的1個DNA蟲媒病毒[1]。ASFV成熟病毒粒子共編碼54種結構蛋白[2]，其中p30、p54和p72在抗原檢測中應用較為廣泛，研究表明，p30蛋白在非洲豬瘟病毒感染早期表達，適用于ASF疫病的早期診斷；而p54蛋白的免疫原性較好，結構保守，在機體中產生抗體時間早且持續時間長久；p72蛋白在病毒感染后的晚期進行表達，保守性較強且免疫原性好，是目前研究最多的用于診斷的結構蛋白[3]。核酸檢測PCR技術通常根據ASFV的B646L基因的高度保守區來設計引物和探針，對疑似病例進行檢測，在此方法中，PCR的擴增效率會因引物的位置和堿基組成不同而存在一定差異[4]，本文將對非洲豬瘟的實驗室檢測技術進行綜述，以期為非洲豬瘟防控提供參考。

1 非洲豬瘟傳播概況

20世紀初，非洲豬瘟病毒最早發現于東非地區，1957年在伊比利亞半島流行；20世紀中期，擴散至西非、加勒比、西歐、東歐等多個國家和地區[5]。2007年非洲豬瘟疫情首次傳入高加索地區，2009年進入俄羅斯，2012年從俄羅斯轉向烏克蘭，2013年傳入白俄羅斯[6]。2018年8月，在我國遼寧沈陽首次發生了非洲豬瘟疫情，隨后在我國的31個省份陸續點狀散發。非洲豬瘟的高傳播速度和高致死率一度導致我國生豬、豬肉及相關產品供給緊張、價格高漲。非洲豬瘟對全球養豬業都造成了嚴重的影響，僅2020年全球就有27個國家和地區發生了2 538起家豬疫情和8 188起野豬疫情，共計10 726起。

目前，全球還沒有商品化大量生產的ASF疫苗。中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所正在研發的疫苗有2種，分別是非洲豬瘟病毒基因缺失活疫苗（HLJ/18-7G D株）和非洲豬瘟弱毒活疫苗（HLJ/18-7GD株），這2種疫苗均獲得了2020年的臨床試驗批件。其中，非洲豬瘟弱毒疫苗于2020年底完成了其實驗室創制、中間試制、生物安全環境釋放試驗及第一階段臨床試驗等，且該弱毒疫苗的生物安全生產試驗和第二階段臨床試驗也在推進中。其實當前仍沒可以商業化生產的非洲豬瘟疫苗，因此在非洲豬瘟疫苗上市之前，病原的及時檢測和嚴格的生物安全措施仍是防控非洲豬瘟的主要手段。

2 非洲豬瘟病毒的檢測技術

隨著非洲豬瘟疫情在全球的不斷發展，抗原、抗體快速診斷技術、方法層出不窮，國內外科研人員建立了多項抗原和抗體檢測技術，并在檢測實驗室臨床應用。國內標準方面，2020年12月14日國家標準化管理委員會發布了《非洲豬瘟診斷技術》(GB/T 18648-2020)[7]，分別從非洲豬瘟病毒核酸檢測、病毒完整顆粒檢測和非洲豬瘟病毒抗體檢測等3方面規定了非洲豬瘟病毒的實驗室診斷技術和方法。其中，非洲豬瘟病毒核酸檢測技術包括普通PCR檢測法、熒光定量PCR檢測法、環介導等溫擴增技術、重組酶介導等溫核酸擴增技術、微流控芯片檢測法5種。非洲豬瘟病毒完整顆粒檢測方法包括病毒的分離培養技術、夾心ELISA抗原檢測法和高敏熒光分析法3種。非洲豬瘟病毒抗體檢測方法包括膠體金免疫層析技術和ELISA抗體檢測方法2種。

2.1 非洲豬瘟病毒核酸檢測技術

2.1.1 普通PCR檢測法

世界動物衛生組織（OIE）推薦的PCR檢測法是針對ASFV的vp73基因設計引物后擴增出257 bp基因片段，來確診該病的[8]。Giammarioli等[9]則通過研究建立了非洲豬瘟病毒、豬瘟病毒、圓環病毒2型、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、豬偽狂犬病毒等5種病毒的多重PCR檢測，多重PCR檢測法緩解了實驗人員檢測多個病毒需要多次檢測才能實現的壓力。目前，PCR技術以其快速、靈敏的檢測特點，廣泛應用于ASFV的實驗室診斷，但PCR技術在對擴增產物進行分析時也存在一定的缺陷，即PCR擴增時需要開蓋二次加引物，容易造成樣品的交叉污染而出現假陽性。此外，待檢樣品中可能存在的酶也會抑制病毒核酸的檢出，從而出現假陰性的結果[10]。

2.1.2 熒光定量PCR檢測法

熒光定量PCR檢測法是檢測核酸樣品由定性到定量的轉變，同時提高了核酸檢測的敏感性、特異性及檢測效率等。OIE推薦的熒光定量PCR檢測法是依據ASFV的B646L基因保守序列設計的探針[11]進行病毒基因擴增。王彩霞等[12]則根據非洲豬瘟病毒CD2v基因序列，設計了TaqMan熒光PCR引物和探針，建立了ASFV的TaqMan實時熒光PCR檢測法，且其最低檢測下限可達到10 copies/L。史喜菊等[13]建立了豬瘟、非洲豬瘟和豬水泡病毒等多重熒光RT-PCR同步檢測和鑒別診斷方法，三重熒光PCR可以達到與單重熒光PCR相等的指標參數，實現同時檢測和鑒別3種病毒的目的。

2019年中國動物疫病預防控制中心等單位合作研發的熒光PCR檢測ASFV試劑盒獲得二類新獸藥注冊，后續國內又有4項同類產品注冊成功。2020年12月新發行的《非洲豬瘟診斷技術》[7]將國內檢測非洲豬瘟病毒的主要方法定為以ASFV的vp72基因保守序列為靶標建立的熒光定量PCR檢測法。

2.1.3 環介導等溫擴增技術

2000年，環介導等溫擴增技術（LAMP）作為一種由BST酶介導的且反應溫度單一的恒溫核酸擴增新技術出現并廣泛應用[14]。隨后，王林等[15]根據p72基因設計引物，建立了基于SYTO9熒光染料的實時熒光LAMP快速法檢測非洲豬瘟病毒，該方法最低可檢測基因片段的量為10 copies/μL，與農業農村部推薦的熒光定量PCR法檢測結果的符合率為100%，具有反應速度快（40 min）、靈敏度高、操作簡便、不易污染、適用儀器廣等優勢。2019年，北京森康生物技術開發有限公司利用環介導等溫擴增技術研發了檢測非洲豬瘟病毒的試劑盒，并成功注冊成為第一個利用環介導等溫擴增技術檢測非洲豬瘟病毒的檢測試劑盒。

2.1.4 重組酶介導等溫核酸擴增技術

近年來，重組酶介導等溫核酸擴增法（RAA）檢測基因技術日益興起，重組酶介導等溫核酸擴增法運用的酶主要是細菌或真菌的重組酶。細菌和真菌的重組酶與噬菌體的重組酶相比其來源廣泛、對溫度的適應性強[16]。趙凱穎等[17]運用重組酶介導等溫核酸擴增法擴增了非洲豬瘟病毒的p72基因序列，在擴增過程中，該方法表現出靈敏度高和用時短的特點，其靈敏度可達10 copies/μL，且檢測時長僅需10 min。目前，我國在運用重組酶介導等溫核酸擴增法檢測非洲豬瘟病毒時，推薦以病毒B646L基因的保守序列為檢測靶標，利用熒光標記的探針追蹤目的片段進行檢測[7]。重組酶介導等溫核酸擴增檢測法在靈敏度和反應用時方面都有一定的優勢，且具有廣闊的發展前景。

2.1.5 微流控芯片檢測法

微流控芯片技術（microfluidic chip technology）是20世紀90年代提出的一種借助微米級通道操控微液滴流動的新型技術，近年來有研發人員將該方法與光學傳感技術相結合，使其在生物醫學診斷領域得到了全新的應用與發展。微流控芯片法作為被推薦的即時檢驗檢測ASFV的方法被列入我國2021年7月份實施的出入境檢驗檢疫行業標準中[18]，該方法針對ASFV的p72基因序列設計特異性引物，并將其固定于芯片反應室后對芯片進行封裝，隨后把提取的核酸模板與含有SYBR Green熒光染料的反應液混合后加入到封裝好的芯片內，借助帶有離心功能、恒溫功能及實時熒光檢測一體化的微流控芯片檢測儀對產生的熒光信號進行收集與分析，從而達到對ASFV檢測的目的。該方法將樣品制備、反應、分離、檢測等基本單元集成到微米級尺寸的芯片上，然后自動完成分析全過程，不受試驗場地及條件限制，可實現“樣本進，結果出”的便捷檢測，適合現場快速檢測。

2.2 非洲豬瘟病毒完整顆粒檢測方法

2.2.1 非洲豬瘟病毒的分離培養

非洲豬瘟病毒的分離與培養是OIE推薦的診斷非洲豬瘟病毒的黃金標準，一般采用紅細胞吸附試驗（HAD）進行ASFV的分離確診。首先將可能攜帶病毒的組織分離，如豬的血液、淋巴結、脾臟等，然后取病料樣品進行細胞培養，分離病毒粒子，再將病料培養的病毒粒子接種在原代白細胞中，觀察細胞病變效應（cytopathic effect,CPE），最后取健康豬的血液與接種的白細胞共同孵育，顯微鏡下觀察白細胞的變化，如果白細胞表面有大量豬紅細胞附著，則判定為陽性[19]。該方法試驗周期較長，且直接接觸病原可能會增加病原體擴散污染的風險，此外，應用該方法時，如果待檢樣品中病毒載量較低，則白細胞表面附著紅細胞的現象不明顯，易出現假陰性結果，因此不適用于現場大量檢測。

2.2.2 夾心ELISA抗原檢測法

雙抗體夾心ELISA抗原檢測方法主要是將特異性反應抗體的固相載體包被在96孔板中，然后向96孔中加入待檢樣品（抗原）及酶標記抗體共同孵育，使抗原、抗體和酶標記抗體結合后，根據反應液的顏色反應來判斷抗原含量，從而達到對待檢樣品進行定性或定量分析的方法。Vidal和Aydin等[21,22]利用夾心ELISA抗原檢測法檢測了非洲豬瘟病毒p72基因的單克隆抗體。當前，我國制定的檢測非洲豬瘟病毒的標準是將ASFV p30蛋白單克隆抗體作為包被抗體，將辣根過氧化物酶標記的p30蛋白單抗（針對p30蛋白不同表位）作為酶標抗體對待檢樣品進行檢測[8]。此法操作較簡便，可降低假陽性風險。

2.2.3 高敏熒光免疫分析法

高敏熒光免疫分析法是將鑭系元素與免疫層析技術結合的一種分析方法。該方法是針對目的基因片段設計引物或探針時，在引物或探針上標記或包埋鑭系螯合物作為熒光信號，最后參照熒光標準信號的濃度曲線對待測樣品的目的基因片段濃度進行定量檢測[20]，我國新實行的非洲豬瘟檢測標準中以鑭系元素螯合物為追蹤信號，結合抗原抗體免疫層析技術，達到檢測ASFV抗原的目的[8]。

2.3 非洲豬瘟病毒抗體檢測方法

2.3.1 膠體金免疫層析技術

免疫膠體金技術（Immune Colloidal Gold Technique）是一種以膠體金為示蹤標志物的抗原抗體免疫標記技術。張鑫宇等[23]運用此方法建立了ASFV的p54抗體檢測膠體金免疫分析試紙條，該試紙條的臨床檢測樣品的準確率高于OIE推薦的ELISA檢測法。吳海濤等[24]以原核表達的PET-30A-P72蛋白作為抗原免疫兔子制備陽性血清，以雜交瘤細胞株接種小鼠獲得ASFV的單克隆抗體，建立了ASFV膠體金免疫層析法試紙條，該試紙條的特異性、靈敏性和穩定性均較好。膠體金免疫層析法操作簡單、快速，不需要儀器，適用于對國內大型豬場的疫病監測及大規模排查。

2.3.2 ELISA抗體檢測方法

ELISA抗體檢測是目前血清學檢測中最常用的方法。Pastor等[25]利用非洲豬瘟病毒感染的細胞培養物中高特異胞質可溶性抗原（CS-P）作為包被抗原建立的間接ELISA抗體檢測法適用于ASFV感染的早期檢測。曹琛福等[26]基于非洲豬瘟病毒的p54蛋白建立了阻斷ELISA抗體檢測法，該法成為深圳市地方檢測非洲豬瘟病毒的標準。目前，我國有2種檢測非洲豬瘟病毒的ELISA抗體檢測標準，分別是以包被抗原桿狀病毒表達的P30重組蛋白建立的間接和阻斷ELISA抗體檢測法、和以包被抗原P54重組蛋白建立夾心ELISA抗體檢測法[7]。ELISA檢測法適用于ASFV抗體檢測，主要用于ASF流行區域的低毒力ASFV感染的豬只，隨著基因缺失弱毒疫苗的研發，未來還需要配套區分野毒感染和疫苗免疫的抗體檢測技術。

3 國內非洲豬瘟病毒診斷制品的注冊情況

中國動物疫病預防控制中心于2018年12月和2019年4月分別組織了2次非洲豬瘟病毒現場快速檢測試劑評價工作。2019年6月11日公布第二批通過評價的34項檢測試劑名單，包括28項熒光定量PCR類和6項等溫擴增類檢測試劑產品，試紙條類產品全部未通過評價。

2020年8月27 日，農業農村部辦公廳發布《關于非洲豬瘟病毒診斷制品生產經營使用有關事宜的通知》，要求自2020年9月1日起，未在通過評價的34項檢測試劑名單中，以及名單中目前未申請注冊的ASFV診斷制品，一律停止生產經營；自2021年1月1日起，全部使用已取得批準文號的ASFV診斷制品。

截至2021年9月中旬，全國有5項非洲豬瘟檢測試劑通過新獸藥注冊評審，獲得農業農村部頒發的《新獸藥注冊證書》 （見表1）；有13家企業、10項不同產品（12項熒光PCR法、1項等溫擴增法）獲得農業農村部頒發的獸藥產品批準文號（見表2），其中3項同表1列出的《新獸藥注冊證書》產品、3項為改良型獸醫診斷制品，直接核發獸藥產品批準文號。

表1 非洲豬瘟檢測試劑新獸藥注冊證書列表

表2 非洲豬瘟檢測試劑批準文號列表

4 小結

自2018年非洲豬瘟疫情在我國發生以來，ASFV抗原、抗體檢測技術飛速發展，為應對非洲豬瘟疫情，中國動物疫病預防控制中心通過3次非洲豬瘟病毒現場快速檢測試劑評價，選出了幾十種可用于非洲豬病病毒檢測的試劑，供檢測機構應急使用。通過新獸藥注冊診斷制品的批準上市和新版《非洲豬瘟診斷技術》國家標準出臺，為非洲豬瘟疫情監測提供了技術保障。隨著疫情的蔓延，ASFV的防控和凈化是長期的過程，對ASFV的早期診斷以及免疫后抗體水平檢測的需求也不斷提升，快速、準確、便捷的診斷技術是控制和預防非洲豬瘟的重要手段。