藥食同源材料組合中二氫楊梅素水提工藝優化

張榮彬 高文明 戴志勇 陳振桂 任國譜

(1.中南林業科技大學食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004；2.英氏控股集團股份有限公司，湖南 長沙 410005)

藥食同源材料組合是根據宋代醫學家錢乙《小兒藥證直訣》著名方劑“導赤散”加減而來，試驗所用搭配及比例為：藤茶(30%)、桑葉(15%)、菊花(15%)、蘆根(10%)、麥芽(10%)、甘草(10%)以及淡竹葉(10%)。

藤茶作為類茶植物已被廣泛應用于食品行業，其有效成分為黃酮類物質(如蛇葡萄素、二氫楊梅素、楊梅素、福建茶素、龍涎香醇、β-谷甾醇、楊梅黃素和楊梅苷等)，具有降低體內寒氣、清除燥熱、降低血壓與血脂并保護肝臟的作用[1-3]，其提取方法主要有水提法、醇提法、微波輔助萃取法以及超聲提取法等[4]。桑葉的成分有黃酮類、多糖類、脂類、生物堿、揮發油、植物甾醇和綠原酸等[5]，其提取方法主要有熱水、醇和稀堿等溶劑提取法；超聲輔助乙醇提取桑葉黃酮類化合物耗時少且增效明顯[6]。菊花主要含有黃酮類、多糖、揮發油和氨基酸等成分[7]；其黃酮類成分中二氫楊梅素可采取醇解法和熱水提取[8]。蘆根具有清熱生津、除煩、止嘔和利尿的作用；蘆根含有糖類、黃酮類、蒽醌類、酚類、甾體類、小分子酚酸以及揮發性成分[9]等，可用水煎和醇沉淀法提取[10]。麥芽中含有較多功能性纖維素，如富含谷胺酰胺的蛋白質纖維素，可以治療潰瘍性結腸炎[11]，采用水提可發揮助消化作用，也可用90%乙醇回流提取[12]。甘草是一種補益中草藥，其甘草總黃酮是甘草抗炎活性組分之一，而異甘草素是甘草總黃酮抗炎的活性成分[13]；藥用成分主要包括甘草黃酮、甘草酸、甘草多糖和甘草次酸等，可用溶劑提取法、超聲輔助提取法或者微波輔助提取法等進行提取[14]。淡竹葉的化學成分有黃酮類、三萜類、酚性成分、有機酸、氨基酸和糖類等[15]，可用水和甲醇提取或60%的乙醇回流提取[16]。

近年來，針對二氫楊梅素物質提取研究大多集中于單一物質材料，并未見對藥食同源材料組合的提取研究。目前關于二氫楊梅素大多使用乙醇進行浸提[17-19]，也有使用丙酮[20]、超聲波[21]和酶法[22]進行提取的，而用熱水提取也可以達到一定的效果[23-26]，并且所用藥食同源材料組合中各味藥中的有效成分大都可以溶于熱水且傳統中藥多為水煎，無有機溶劑的殘留，在食品工業中能保證一定的安全性，在成本控制方面也具有無可比擬的優勢。研究擬采用熱水回流提取法提取藥食同源材料組合中的二氫楊梅素，并優化其提取工藝，旨在為藥食同源材料開發及浸膏粉的生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藤茶、蘆根、麥芽、甘草、淡竹葉、桑葉和菊花：桑植縣華遠生物科技有限公司；

二氫楊梅素：濃度>98%，北京壇墨質檢科技有限公司；

磷酸、甲醇、乙腈：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀：Waters e2695型，美國Waters公司；

電子分析天平：CP114型，上海奧豪斯儀器有限公司；

數控超聲波清洗器：KQ-5200DV型，昆山市超聲儀器有限公司；

三用恒溫水箱：HH-600型，金壇市神科儀器廠；

電熱恒溫鼓風干燥箱：WGL-125B型，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備 取藥食同源材料組合65 g，進行篩選除雜，選擇m藤茶∶m桑葉∶m菊花∶m蘆根∶m麥芽∶甘草∶m淡竹葉=30%∶15%∶15%∶10%∶10%∶10%∶10%，即藤茶19.5 g，桑葉、菊花各9.75 g，蘆根、麥芽、甘草以及淡竹葉各6.5 g。

1.3.2 二氫楊梅素含量的測定 根據文獻[27—28]并修改，具體操作：

(1)樣品處理：取篩選除雜后的藥食同源材料組合65 g，按照試驗方案，加水浸泡，進行回流提取，過濾后收集、合并提取液，并將其定容至1 000 mL容量瓶后混勻，移取提取液各1 mL，置于5 mL EP管中，加入3 mL甲醇，搖勻，用0.45 μm微孔薄膜過濾，即得供試品溶液。

(2)色譜條件：選用色譜柱為Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相乙腈—水—磷酸(V乙腈∶V水∶V磷酸=15∶85∶0.1)，檢測波長290 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量5 μL。

(3)對照品溶液的制備：精密稱取12.0 mg二氫楊梅素置于25 mL容量瓶中，加少量甲醇，超聲溶解，定容至刻度，搖勻，即得濃度為48.0 μg/mL的對照品溶液，根據色譜條件，測定標準品溶液，記錄其二氫楊梅素標準品色譜。

(4)進樣操作：精密吸取對照品溶液10 μL與供試品溶液5 μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，進行計算。

1.3.3 浸膏得率測定 取提取液25 mL于干燥至恒重的蒸發皿，恒溫水浴(90±5)℃蒸干，105 ℃下干燥3 h，干燥器中冷卻30 min，稱重后按(1)式計算浸膏得率。

(1)

式中：

C——浸膏得率，%；

m1——蒸發皿與提取液質量，g；

m2——蒸發皿質量，g；

m3——提取液蒸干、干燥后質量，g。

1.3.4 單因素試驗

(1)提取次數對二氫楊梅素含量和浸膏得率的影響：稱取藥食同源材料組合65 g，加水浸泡1 h，加熱回流提取3次，第1次加水體積為其質量的8倍提取1.5 h，第2次和第3次加水體積為其質量的6倍并提取1.0 h，提取結束后對提取液進行收集，共3份提取液。將3份提取液分別定容至1 000 mL且混合均勻后各取適量，液相色譜法測定二氫楊梅素提取量，并計算浸膏得率。

(2)浸泡時間對二氫楊梅素含量和浸膏得率的影響：準確稱取藥食同源材料65 g，加水浸泡0.5，1.0，1.5，2.0 h，加熱回流提取2次，第1次加水體積為其質量的8倍提取1.5 h，第2次加水體積為其質量的6倍提取1.0 h，提取結束后對提取液進行收集，共3份提取液，將其定容至1 000 mL并混合均勻，液相色譜法測定二氫楊梅素提取量，并計算浸膏得率。

(3)加水量對二氫楊梅素含量和浸膏得率的影響：準確稱取藥食同源材料65 g，加水浸泡1.0 h，加熱回流提取2次，第1次加水體積分別為其質量的6，8，10，12倍提取1.5 h，第2次加水體積分別為其質量的4，6，8，10倍提取1.0 h，提取結束后對提取液進行收集，共3份提取液，將其定容至1 000 mL并混合均勻，液相色譜法測定二氫楊梅素提取量，并計算浸膏得率。

(4)提取時間對二氫楊梅素含量和浸膏得率的影響：準確稱取藥食同源材料65 g，加水浸泡1.0 h，加熱回流提取2次，第1次加水體積為其質量的8倍分別提取1.0，1.5，2.0，2.5 h，第2次加水體積為其質量的6倍分別提取0.5，1.0，1.5，2.0 h，提取結束后對提取液進行收集，共3份提取液，將其定容至1 000 mL并混合均勻，液相色譜法測定二氫楊梅素提取量，并計算浸膏得率。

1.3.5 正交試驗 采用L9(34)正交表，根據單因素試驗結果，選擇浸泡時間、加水量和提取時間為考察因素，考察指標為二氫楊梅素提取量和浸膏得率。

綜合評分時需參考各指標的最大值，數據用歸一化處理，在數據統計分析時需根據各指標影響作用大小分析不同權重，其公式為：

(2)

式中：

Z——綜合評分；

M1——二氫楊梅素提取量，mg；

M2——最大二氫楊梅素提取量，mg；

C1——浸膏得率，%；

C2——最大浸膏得率，%。

1.3.6 數據處理與分析 采用SPSS 20.0軟件與Ecxel軟件對試驗數據進行分析和處理，采用Origin 2019進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取次數 藥食同源材料組合中二氫楊梅素易溶于乙醇、丙酮等有機溶劑，但因考慮到藥食同源材料組合中各材料多為水煎，并考慮到安全性及未來可能會在嬰幼兒產業中的應用采用熱水提取。由表1可知，對65 g藥食同源材料組合進行第1次提取時，二氫楊梅素提取量為2 910.26 mg，浸膏得率為17.40%；隨著提取次數的增加，二氫楊梅素提取量從第2次的825.61 mg降為260.09 mg，浸膏得率從7.60%下降到4.10%。

表1 提取次數對提取效果的影響

提取次數對藥食同源材料組合中二氫楊梅素提取量具有重要影響。二氫楊梅素提取量會隨著提取次數的增加而升高，但第3次提取時二氫楊梅素提取量已明顯低于前2次提取，原因可能是藥食同源材料組合中二氫楊梅素的提取在前2次提取時已達飽和，可能熱水并沒有有機溶劑對植物細胞壁持續強穿透及活性物質溶解作用，導致其二氫楊梅素提取量不會因提取次數增加而過多變化，提取次數的增加雖會增加其提取量，但對后續提取效果已無顯著影響，并無實際意義，反而增加成本和負擔，故試驗采取2次即可滿足提取要求。

2.1.2 浸泡時間 由圖1可以看出，隨著浸泡時間的延長，65 g藥食同源材料組合中二氫楊梅素提取量和浸膏得率有逐漸升高的趨勢；二氫楊梅素提取量從2 565 mg增長為3 056 mg，浸膏得率從20.5%增長為25.8%；分析各階段的增長率可知，二氫楊梅素提取量的增長率在逐漸變小，由8.97%減小至4.77%，而浸膏得率的增長率逐漸變大，由4.04%增加到11.02%。

圖1 浸泡時間對提取效果的影響

二氫楊梅素提取量增加是因為隨著浸泡時間的增加，藥食同源組合材料會充分與熱水接觸，熱水會對植物細胞壁造成破壞，從而導致二氫楊梅素的浸出；二氫楊梅素提取量的增長率降低是因為熱水對植物細胞壁破壞效果有限，熱水的破壞效果達到閾值，細胞內外二氫楊梅素提取量達到平衡，導致二氫楊梅素浸出的速率開始降低，所以二氫楊梅素提取量的增長率降低。浸膏得率升高是因為桑葉、菊花、麥芽、甘草與淡竹葉在熱水條件下，二氫楊梅素浸出的同時其自身水溶性物質會因熱水而浸出[28]，因此會使浸膏得率增加，故浸泡1.5 h即可滿足要求。

2.1.3 加水量 由圖2可以看出，65 g藥食同源材料組合中二氫楊梅素提取量和浸膏得率隨加水量的增加有逐漸升高的趨勢，二氫楊梅素提取量從2 345 mg增長到3 498 mg，浸膏得率從22.5%增長到25.5%；此外，試驗還發現，二氫楊梅素提取量的升高趨勢比浸膏得率大，但二者的增長率卻都在不斷減小，前者由22.64%減小至4.32%，后者由6.67%減小至2.00%。因為隨著加水量的增加，熱水積溫效果會使水溫更好地維持在一定范圍內，增加的熱水量越多，水溫下降速度越慢，所以在一定范圍內增大加水量會有利于二氫楊梅素和一些水溶性物質的快速浸出，而且提取液中水溶性成分及雜質也會變多，但隨著熱水增加，料液比會逐漸升高，當加水量為10倍/8倍時，提取效果已不再明顯。

圖2 加水量對提取效果的影響

同時試驗結果還表明，當加水量為6倍/4倍時，溶液黏度較高，或因料液比太低所致，且對二次提取產生不利影響。因此，加水量為10倍/8倍時即可滿足要求。

2.1.4 提取時間 由圖3可以看出，65 g藥食同源材料組合中二氫楊梅素提取量隨提取時間的延長而逐漸升高，提取量從2 635 mg增長到2 952 mg，二氫楊梅素提取量的增長率逐漸減小，由6.19%減小至1.37%；浸膏得率隨提取時間的延長而逐漸升高，從21.5%增長到27.5%；浸膏得率的增長率隨提取時間的延長基本保持一致，并無明顯波動；二氫楊梅素提取量的增長率的降低一方面是因為隨提取時間的延長，二氫楊梅素浸出后與熱水接觸時間變長，熱水的高溫導致二氫楊梅素發生氧化作用，導致其提取量降低；另一方面是隨著提取時間變長，所得提取液會形成膠狀溶液，導致其過濾及后續操作損失嚴重。因此需要選擇合適提取時間。浸膏得率的增長率隨提取時間的延長基本保持一致且無明顯波動，是因為高溫作用可以使水溶性物質逐步溶解浸出，彌補了提取時間延長過程中二氫楊梅素的氧化損失，所以浸膏得率也緩慢增大。因此，提取時間為1.5 h/1.0 h即可滿足要求。

圖3 提取時間對提取效果的影響

2.2 正交試驗分析

根據單因素試驗結果，選擇浸泡時間、加水量和提取時間為考察因素，考察指標為二氫楊梅素提取量和浸膏得率。

試驗采用L9(34)正交表，所選因素水平及試驗結果見表2和表3。

表2 正交試驗因素水平表

根據表3數據，以綜合評分為標準，在所選因素水平范圍內，各因素作用順序為B(加水量)>A(浸泡時間)>C(提取時間)，得到最優方案為A1B3C2。

表3 正交試驗設計及結果

表4方差分析結果表明：加水量的變化會影響二氫楊梅素提取量，且優于浸泡時間和提取時間，加水量對藥食同源材料組合中二氫楊梅素的提取效果有顯著影響(P<0.05)，浸泡時間和提取時間對提取效果無顯著影響。因此，綜合上述試驗結果得到水提工藝的最優條件為A1B3C2，即藥食同源材料組合加水浸泡0.5 h，回流提取2次，第1次加水體積為其質量的10倍提取1.5 h，第2次加水體積為其質量的8倍提取1.0 h。

表4 方差分析結果?

稱取3份65 g的藥食同源材料組合，根據得到的正交試驗最優選擇對提取工藝條件進行驗證。表5試驗結果顯示優選出的最佳方案A1B3C2具有良好的重現性，表明此提取工藝條件合理、穩定、可操作性強。

表5 驗證實驗結果

3 結論

采用熱水浸提法提取藥食同源材料組合藤茶中二氫楊梅素的最優條件為加水浸泡0.5 h，回流提取2次，第1次加水體積為其質量的10倍提取1.5 h，第2次加水體積為其質量的8倍提取1.0 h。在此最佳條件下，65 g藥食同源材料組合中二氫楊梅素提取量為3 761.14 mg，浸膏得率為31.42%，綜合評分為99.47，該工藝可滿足藥食同源材料組合中二氫楊梅素的提取要求且大大提高提取效率。

試驗彌補了過往只對單一物質材料研究提取的空白，而且熱水浸提生產成本低，無有機溶劑殘留，安全性高，藥食同源材料中提取物大多為中藥成分，可應用于嬰幼兒輔助食品。在后續研究中應充分對藥食同源材料的功能性和適用性進行深入研究，亦可根據不同應用領域探究適合的提取方法以及分離純化，充分發揮藥食同源材料這一寶貴的資源。