正交法優化超聲波輔助棗皮紅色素提取工藝研究

王釗，李長濱，李玉江，許俊亞，李青靜，張本尚，鄒建*

(1.河南牧業經濟學院 食品與生物工程學院，鄭州 450046；2.河南省科學院高新技術研究中心，鄭州 450002)

長期以來，合成色素被大量用于食品生產，雖然合成色素廉價易得、性質穩定、色彩艷麗[1]，但其本身具有潛在的安全隱患，在人體內可代謝生成致癌物[2]，因此，對天然色素的開發成為人們關注的焦點。近年來，人們陸續研究開發了多種天然紅色素，不但色彩鮮艷多樣，還各自具有獨特的生理功能，對合成色素形成了有效的補充。如甜椒紅色素色澤光亮、色度穩定、視感良好，并可抗氧化、預防動脈粥樣硬化[3]；山楂紅色素具有防癌抗癌、保護大腦、保肝護腎等多重保健功效以及良好的抗氧化和著色能力[4]。

在眾多天然紅色素中，紅棗色素引起了人們的廣泛興趣。紅棗為鼠李科棗屬植物的果實，與桃、李、栗、杏合稱為我國古代的“五果”，是我國北方的重要果樹之一[5]。紅棗的營養成分豐富，不但被譽為“天然維生素丸”，還富含蛋白質、糖類、脂肪、有機酸、多種礦物質及胡蘿卜素等營養成分[6-7]，以其藥食同源的優點受到人們的喜愛[8-9]。其中，新鄭紅棗作為河南特色名棗，歷史悠久、味道醇美，早已享譽中外[10]，除富含食品營養成分外，還含有多酚等多種功能成分[11]。但是，與現代食品工業相比，傳統的餐飲加工模式對紅棗資源的利用率卻相對較低。例如，紅棗皮中含有大量天然棗皮紅色素，然而在許多食品的加工過程中往往將棗皮遺棄，對資源造成了極大的浪費。

研究表明，棗皮紅色素色澤濃郁純正，對光和熱均較穩定，水溶性好，同時具有抗氧化、抗腫瘤、補血養氣、止瀉、抗菌、消除自由基等保健功能，可廣泛用于食品、醫藥及化妝品著色[12]。當前對棗皮紅色素的提取研究方法主要為溶劑浸提法，輔以超聲波、微波、酶法等輔助提取手段，提取液多為不同濃度的NaOH水溶液[13]。鑒于此，本文擬對多種提取液進行篩選，特別是擴大NaOH之外的其他堿的種類，采用溶劑浸提法對棗皮紅色素進行提取，并考察了超聲波輔助提取法對棗皮紅色素提取效果的影響，最后通過四因素三水平正交試驗法在各單因素較優水平的基礎上進一步優化提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鄭紅棗：鄭州市丹尼斯超市大學路店；氫氧化鈉(分析純)：天津市永大化學試劑有限公司；氫氧化鉀(分析純)、無水碳酸鈉(分析純)、無水乙酸鈉(分析純)、冰乙酸(分析純)：天津市科密歐化學試劑有限公司；無水碳酸鉀(分析純)：天津市盛奧化學試劑有限公司；無水甲醇(分析純)：西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設備

RHP-500A型微型植物粉碎機 浙江永康市榮浩工貿有限公司；HWCL-3型集熱式恒溫磁力攪拌器、星火牌C型玻璃儀器氣流烘干器 鄭州長城科工貿有限公司；AE224型電子分析天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；RE-52型旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；DSX-9243型電熱鼓風干燥箱 河南捷隆科技有限公司；FreeZone型真空冷凍干燥儀 美國Labconco儀器公司；SB25-12DTD型超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 試驗步驟

1.3.1 紅棗的預處理

參照張紅等的處理方法，選擇顆粒完整飽滿的紅棗，在沸水中煮5 min，然后立即放入冷水中，除去果肉，剝取棗皮，經挑選除雜后，清洗2～3次，將棗皮放入鼓風干燥箱中，于40 ℃條件下烘干至恒重，然后將干棗皮制成棗皮粉末(40目)，置于干燥器中備用。

1.3.2 篩選不同的提取溶液

分別稱取7份干燥后的棗皮粉末(0.5 g/份)，將棗皮粉末置于100 mL圓底燒瓶內，分別加入NaOH溶液(0.2 mol/L)、KOH溶液(0.2 mol/L)、K2CO3溶液(0.2 mol/L)、Na2CO3溶液(0.2 mol/L)、乙酸鈉溶液(0.2 mol/L)、甲醇和50%冰乙酸水溶液，設置提取溫度60 ℃、提取時間3 h、料液比1∶20，在此條件下初步提取棗皮紅色素[14]。停止反應，待反應液冷卻至室溫后過濾并濃縮，將濃縮液移至50 mL容量瓶中定容；然后，從中準確稱取5 mL溶液，再次轉移到50 mL容量瓶中定容。以相應提取溶劑為空白，通過紫外可見分光光度計進行全波段掃描，觀察紫外吸收曲線，確定不同提取溶液中棗皮紅色素的最大吸收波長位置。

1.3.3 單因素試驗設計方案

分別考察溶液濃度(0.1～0.6 mol/L，每組間隔為0.1 mol/L)、料液比(1∶10～1∶35，每組間隔為1∶5)、提取溫度(30～90 ℃，每組間隔為10 ℃)、超聲時間(10～50 min，每組間隔為10 min)、提取時間(1～5 h，每組間隔為1 h)5個單因素條件。保持該5個單因素中的4個因素不變，依次考察溶液濃度、料液比、提取溫度、提取時間、超聲時間等因素變化對提取棗皮紅色素的影響，通過優化各單因素條件，使5個單因素提取條件分別達到最優水平。

1.3.4 正交試驗設計方案

在5個單因素試驗條件優化的基礎上對試驗結果進行分析，并綜合考慮各因素對棗皮紅色素提取效果的影響。固定超聲波輔助提取時間不變，選取溶液濃度、料液比、提取溫度、提取時間4個因素中的較優水平，采用L9(34)正交試驗水平表設計正交試驗，進一步優化提取棗皮紅色素的工藝條件。

1.3.5 對最優工藝條件的驗證

在正交試驗得出的最優提取工藝條件下重復提取棗皮紅色素3次，以便驗證正交試驗結果，并對驗證試驗的結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同的提取液對棗皮紅色素提取效果的影響

稱取7份棗皮粉末(0.5 g/份)，將之溶于具有相同濃度的不同提取液中，通過紫外可見分光光度計在 300～740 nm波長范圍內進行全波段掃描，測得每種提取液的最大吸收波長值，見表1。并在各自的最大吸收波長處測得相應吸光度值A，見圖1。

表1 不同溶液的最大吸收波長Table 1 The maximum absorption wavelength of different solutions

由圖1可知，在相同條件下，KOH溶液作為提取棗皮紅色素的提取試劑時，吸光度值最大，提取效果最好，其次依次是NaOH、Na2CO3、K2CO3、乙酸鈉、冰乙酸水溶液、甲醇。考慮到甲醇屬于有毒試劑，因此不予考慮；KOH和NaOH的化學性質相似，綜合考慮二者的安全性、經濟性和提取效果，本文選取KOH溶液作為提取溶劑，并在此基礎上進一步優化試驗內容。

圖1 不同溶液對提取效果的影響Fig.1 Effect of different solutions on the extraction effect

2.2 單因素條件對提取效果的影響

2.2.1 提取溶液濃度對棗皮紅色素提取效果的影響

稱取6份棗皮粉末(0.5 g/份)，分別按照濃度0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mol/L準確配制相應的KOH溶液，以1∶20的料液比在60 ℃油浴中恒溫提取3 h，過濾后定容至50 mL容量瓶中，從中移取5 mL并再次定容至50 mL容量瓶中，在330 nm波長處平行測量3次，其平均吸光度值見圖2。

圖2 不同KOH溶液濃度對提取效果的影響Fig.2 Effect of different KOH solution content on the extraction effect

由圖2可知，隨著提取液中KOH濃度的增大，提取效率隨之增大，當提取液濃度為0.5 mol/L時為最大值。此后，隨著提取液濃度的增加，吸光度值反而減小，因此選取0.5 mol/L的KOH溶液為最佳提取液條件。

2.2.2 料液比對棗皮紅色素提取效果的影響

稱取6份棗皮粉末(0.5 g/份)，分別按照料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35的比例準確量取0.5 mol/L的KOH溶液，在60 ℃油浴中恒溫提取3 h，過濾后定容至50 mL容量瓶中，從中移取5 mL并再次定容至50 mL容量瓶中，在330 nm波長處平行測量3次，結果見圖3中a。

圖3 不同料液比對提取效果的影響Fig.3 Effect of different solid-liquid ratios on the extraction effect

由圖3中a可知，棗皮紅色素的提取效率隨著料液比的增大而增加，料液比1∶20時為最大值；當料液比大于1∶20后，棗皮紅色素的提取效率隨著料液比的增大而降低。為進一步確認最佳料液比條件，以料液比1∶20為中心，對其兩側的料液比進行精確篩選，結果見圖3中b。當料液比從1∶18增至1∶22時，棗皮紅色素的提取效率仍以料液比1∶20時最大，因此選擇1∶20為最佳料液比條件。

2.2.3 提取溫度對棗皮紅色素提取效果的影響

稱取7份棗皮粉末(0.5 g/份)，分別按照0.5 mol/L的KOH溶液和1∶20的料液比，在不同的油浴溫度(30，40，50，60，70，80，90 ℃)下提取3 h，過濾后定容至50 mL容量瓶中，從中移取5 mL并再次定容至50 mL容量瓶中，在330 nm波長處平行測定3次，結果見圖4中a。

圖4 不同提取溫度對提取效果的影響Fig.4 Effect of different extraction temperatures on the extraction effect

由圖4中a可知，棗皮紅色素的提取效率隨著溫度的上升而增大，在30～80 ℃范圍內，溫度越高提取效果越好，80 ℃時效果最佳。當溫度達到90 ℃時，提取效率有所下降，究其原因可能是當溫度過高時棗皮紅色素結構遭到破壞。以80 ℃為中心對其兩側的溫度進行篩選，試驗結果見圖4中b。在70～90 ℃范圍內進一步精確定位提取溫度，可知當溫度上升到85 ℃時提取效率最高，因此選擇85 ℃為最佳提取溫度條件。

2.2.4 提取時間對棗皮紅色素提取效果的影響

稱取5份棗皮粉末(0.5 g/份)，分別按照0.5 mol/L的KOH溶液、1∶20的料液比、85 ℃的提取溫度提取1～5 h，過濾后定容至50 mL容量瓶中，從中移取5 mL并再次定容至50 mL容量瓶中，在330 nm波長處平行測量3次，結果見圖5。

圖5 不同提取時間對提取效果的影響Fig.5 Effect of different extraction time on the extraction effect

由圖5可知，在1～3 h內，提取效率隨著提取時間的增加而提高，3 h時具有最大值；3～5 h之間，隨著提取時間的延長，提取效率持續下降。因此，選擇3 h為最佳提取時間條件。

2.2.5 超聲時間對棗皮紅色素提取效果的影響

稱取5份棗皮粉末(0.5 g/份)，分別按照0.5 mol/L的KOH溶液、1∶20的料液比，分別超聲處理10～30 min后，在85 ℃油浴中恒溫提取3 h，過濾后定容至50 mL容量瓶中，從中移取5 mL并再次定容至50 mL容量瓶中，在330 nm波長處平行測量3次，結果見圖6。

圖6 不同超聲時間對提取效果的影響Fig.6 Effect of different ultrasonic time on the extraction effect

由圖6可知，當超聲時間增長時，棗皮紅色素的提取效率也隨之提高，在超聲時間為20 min時，溶液的吸光度值最大，此后，隨著超聲時間的延長，吸光度值反而下降。超聲時間為20 min時的提取效率遠遠高于其他超聲時間，因此，選擇20 min為最佳超聲提取時間條件。

2.3 正交試驗設計與優化

2.3.1 正交試驗設計

由上述5個單因素試驗結果可知，超聲波輔助提取時間為20 min時提取效果最佳，且遠高于其他時間，因此固定超聲波時間條件不變，對KOH溶液濃度(0.4，0.5，0.6 mol/L)、料液比(1∶19、1∶20、1∶21)、提取溫度(80，85，90 ℃)、提取時間(2，3，4 h)進行四因素三水平正交試驗，從中篩選出棗皮紅色素的最優提取方案。正交試驗具體方案見表2，正交試驗結果見表3。

表2 L9(34)正交試驗因素水平設計表Table 2 The design of factors and levels of L9(34) orthogonal experiment

表3 正交試驗結果Table 3 The results of orthogonal experiment

由表3中極差R值可知，雖然提取棗皮紅色素的4個單因素條件均對提取效果有影響，但各影響因素的影響力卻存在差異。已知各影響因素對棗皮紅色素提取效果的影響力為：C(提取溫度)>D(提取時間)>A(溶劑濃度)>B(料液比)，其中提取溫度對試驗結果的影響最顯著。由正交試驗結果可知，提取棗皮紅色素的最優方案應為A3B2C1D3，即KOH溶液濃度0.6 mol/L、料液比1∶20、提取溫度80 ℃、提取時間4 h。

2.3.2 最優工藝條件驗證試驗

為確保最優工藝條件的真實可靠性，通過3組重復平行試驗對其進行驗證，試驗結果取平均值，見表4。

表4 重復試驗結果Table 4 The results of repeated experiment

由表4可知，驗證試驗結果具有代表性，表明該提取工藝條件合理可行，具有良好的重現性。

3 結論

本文通過對提取液的篩選，首先確定了以KOH溶液為本試驗的提取溶液，然后對提取棗皮紅色素的各單因素條件進行優化。結果顯示各單因素試驗最佳條件分別為：提取液濃度0.5 mol/L的KOH溶液，料液比1∶20，提取溫度85 ℃，提取時間3 h，超聲時間20 min。通過對試驗結果的分析，在正交試驗設計中固定超聲波提取時間20 min不變，則正交試驗最佳提取工藝條件為：KOH溶液濃度0.6 mol/L，料液比1∶20，提取溫度80 ℃，提取時間4 h。經過3次平行重復試驗的驗證，該最佳工藝條件下棗皮紅色素吸光度值的重現性良好。

由試驗結果可知，KOH溶液體系對棗皮紅色素的提取效果明顯優于當前提取棗皮紅色素時普遍采用的NaOH溶液體系，表明本文對提取棗皮紅色素的工藝條件優化結果的可行性和優勢性，也為更深入地研究棗皮紅色素的工業化生產提供了一定的理論支持。