CXCL5在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及其診斷預(yù)后價(jià)值

黃坤平 馮子豪 葛 波▲

1.桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院泌尿外科，廣西桂林 541199；2.桂林醫(yī)學(xué)院，廣西桂林 541004

腎癌是發(fā)病率排名前三的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。在腎癌所有病理類型中，腎透明細(xì)胞癌是最常見(jiàn)、病死率最高的，占75%～80%[2]。腎癌早期多缺乏臨床表現(xiàn)，容易錯(cuò)過(guò)早期診斷而延誤治療[3]。而晚期腎癌患者預(yù)后差，治療手段少。因此，尋找一種腎癌早期檢測(cè)和判斷預(yù)后的標(biāo)志物具有重要的臨床意義。研究表明，趨化因子不僅參與免疫反應(yīng)，還參與腫瘤增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過(guò)程[4-5]。CXCL5作為趨化因子的一員，有研究表明，其在肝癌[6]、膽管癌[7]、大腸癌[8]、前列腺癌[9]等腫瘤中高表達(dá)，并通過(guò)多種機(jī)制調(diào)控腫瘤增殖、遷移。但CXCL5基因在腎癌中的相關(guān)研究還較少。因此，本研究旨在利用數(shù)據(jù)庫(kù)和生物信息學(xué)方法探討CXCL5在腎癌中的表達(dá)情況、診斷及預(yù)后價(jià)值、作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 獲取臨床和基因測(cè)序數(shù)據(jù)

從 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//portal.gdc.ancer.gov/pository）下載腎透明細(xì)胞癌高通量RNA測(cè)序數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)。共獲取539例腎透明細(xì)胞癌和72例癌旁正常腎組織的樣本，其中腎透明細(xì)胞癌與癌旁正常腎臟組織的樣本配對(duì)72例。

1.2 CXCL5 mRNA表達(dá)量差異分析

將RNA測(cè)序數(shù)據(jù)區(qū)分為腎透明細(xì)胞癌組織組和癌旁正常腎組織組，使用R軟件進(jìn)行基因差異表達(dá)及配對(duì)差異分析，比較CXCL5 mRNA在腎透明細(xì)胞癌與癌旁正常腎組織的表達(dá)量差異。

1.3 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證CXCL5 mRNA表達(dá)量

作為TCGA外的大型癌癥基因庫(kù)，Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.oncomine.org/resource/login.html）可實(shí)現(xiàn)諸多功能，如基因表達(dá)差異分析等[10]。設(shè)置檢索條件如下。①Gene：CXCL5；②Analysis Type：Cancervs.Normal Analysis； ③ Data Type：mRNA；④Pvalue：＜ 0.05；⑤ Fold Change：3；⑥ GENE Rank：Top10%；驗(yàn)證CXCL5基因在腎癌與正常腎組織的表達(dá)差異。

1.4 CXCL5 mRNA表達(dá)量與臨床特征的相關(guān)性

利用腎透明細(xì)胞癌患者RNA測(cè)序數(shù)據(jù)和臨床信息，分析CXCL5 mRNA表達(dá)量與年齡、性別、TNM分期、病理分級(jí)等臨床特征的相關(guān)性。

1.5 CXCL5 mRNA在腎透明細(xì)胞癌中的診斷價(jià)值

將534例腎透明細(xì)胞癌組織與72例癌旁正常腎組織的CXCL5 mRNA表達(dá)量進(jìn)行受試者工作特征曲線分析，繪制ROC曲線，并計(jì)算曲線下面積、敏感性和特異性。

1.6 生存分析和回歸分析

以CXCL5 mRNA表達(dá)量的中位數(shù)將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，Kaplan-Meier法制作生存曲線圖。單因素和多因素COX回歸分析篩選影響腎透明細(xì)胞癌總生存期的危險(xiǎn)因素。

1.7 基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）

GSEA是一種基于基因集的富集分析方法，可用于探討目的基因在腫瘤中相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路[11]。將腎透明細(xì)胞癌RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集按CXCL5 mRNA中位值分為CXCL5 mRNA高表達(dá)組和CXCL5 mRNA低表達(dá)組并使用GSEA軟件分析。以P＜0.05，F(xiàn)DR＜0.25的基因集為富集。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究采用R軟件（V.4.0.2）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)分析臨床特征與CXCL5表達(dá)量的關(guān)系；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線圖；采用COX回歸確定影響腎透明細(xì)胞癌患者總生存期的危險(xiǎn)因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CXCL5基因在腎透明細(xì)胞癌中高表達(dá)

基因差異表達(dá)分析和配對(duì)差異分析表明，CXCL5 mRNA在腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)量明顯升高，見(jiàn)圖1～2。

圖1 基因差異表達(dá)分析圖

圖2 配對(duì)差異分析圖

2.2 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證CXCL5基因高表達(dá)

Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步驗(yàn)證得出，CXCL5在腎癌中高表達(dá)，見(jiàn)圖3。

圖3 CXCL5在腎癌中高表達(dá)

2.3 CXCL5 mRNA與臨床特征的相關(guān)性

分析發(fā)現(xiàn)，CXCL5表達(dá)量在不同性別（Gender）、病理分級(jí)（Grade）、T分期以及N分期均有差異，F(xiàn)EMALE、Grade1、T1和N0組的表達(dá)水平低于MALE、Grade4、T4 和 N1 組（P=1.4×10-11，P=0.0082，P=0.018，P=0.0023），見(jiàn)圖4A、B。提示CXCL5表達(dá)量可能與腎透明細(xì)胞癌患者的分級(jí)、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

圖4A CXCL5 mRNA在不同年齡、性別、Stage分期表達(dá)量、Grade分級(jí)對(duì)比

圖4B CXCL5 mRNA在不同TNM分期表達(dá)量對(duì)比

2.4 CXCL5 mRNA在腎透明細(xì)胞癌的診斷價(jià)值

ROC分析顯示CXCL5 mRNA在篩查腎透明細(xì)胞癌具有較好的診斷價(jià)值，其中敏感性為54.7%，特異性為 87.5%，95%CI為 0.676～ 0.768。ROC曲線下面積AUC為0.722，P＜0.05，見(jiàn)圖5。

圖5 CXCL5 mRNA表達(dá)的ROC曲線

2.5 CXCL5可作為判斷預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素

生存分析顯示，CXCL5表達(dá)量越高的患者總生存時(shí)間越短（log rankP=0.00231），見(jiàn)圖6。單因素和多因素COX回歸分析顯示CXCL5表達(dá)量、年齡、病理分級(jí)、M分期是影響腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表1。

表1 單因素與多因素回歸分析臨床特征與總生存時(shí)間的關(guān)系

圖6 生存曲線圖

2.6 GSEA識(shí)別CXCL5相關(guān)的信號(hào)通路

GSEA分析顯示參與ECM-受體相互作用、基因復(fù)制等信號(hào)通路的基因集在CXCL5高表達(dá)組中富集，參與自噬調(diào)節(jié)、PPAR信號(hào)通路、過(guò)氧化物酶等信號(hào)通路在CXCL5低表達(dá)組中富集（P＜0.05，F(xiàn)DR＜0.05）。提示CXCL5可能通過(guò)影響上述通路調(diào)控，見(jiàn)表2。

表2 GSEA分析CXCL5相關(guān)基因集富集參數(shù)

3 討論

趨化因子是一類由人體細(xì)胞分泌的、具有使細(xì)胞定向趨化運(yùn)動(dòng)能力的細(xì)胞因子家族[12]。作為趨化因子家族的一員，CXCL5也稱之為上皮中性粒細(xì)胞活化肽78[13]。近年來(lái)研究表明，在多種惡性腫瘤中CXCL5均高表達(dá)，且與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展及不良預(yù)后相關(guān)。Haider等[14]發(fā)現(xiàn)，CXCL5在肝癌組織中明顯高表達(dá)，CXCL5高表達(dá)的患者表現(xiàn)出更晚期的腫瘤分期。另有研究表明，膀胱癌組織CXCL5表達(dá)升高，且與腫瘤分期有關(guān)[15]。本研究通過(guò)差異表達(dá)分析表明，CXCL5基因在腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)量顯著升高，同時(shí)其表達(dá)量與腎透明細(xì)胞癌的臨床特征相關(guān)。ROC分析證實(shí)了CXCL5在腎透明細(xì)胞癌中的診斷價(jià)值，且具有較高的靈敏度和特異性。生存分析顯示高表達(dá)CXCL5患者的總生存時(shí)間更短，表明CXCL5高表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)。單因素和多因素COX回歸分析得出影響腎透明細(xì)胞癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素為CXCL5表達(dá)水平、年齡、病理分級(jí)、M分期。而T分期、N分期等可能影響總生存期的危險(xiǎn)因素在此研究中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與病例數(shù)相對(duì)較少有關(guān)，仍需多中心、大樣本的研究。

自噬是一種指人類細(xì)胞可以利用溶酶體降解受損、變性或衰老的大分子物質(zhì)以及細(xì)胞器的自我消化活動(dòng)過(guò)程[16]。研究表明，在癌癥初期，機(jī)體通過(guò)自噬維持基因組完整性并防止癌細(xì)胞增殖。但在癌癥后期，癌細(xì)胞可能會(huì)利用自噬抵抗細(xì)胞殺傷反應(yīng)[17-18]。本研究GSEA分析顯示，與自噬相關(guān)通路的基因集在CXCL5低表達(dá)組中富集，而在高表達(dá)組則富集較少，提示CXCL5可能通過(guò)作用于自噬相關(guān)通路來(lái)調(diào)控腎透明細(xì)胞癌。李宏蕾[19]的研究則進(jìn)一步闡釋了CXCL5可能通過(guò)抑制自噬作用促進(jìn)腎細(xì)胞癌進(jìn)展。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisomal proliferators activate the receptors，PPAR）是由脂肪酸和它們的衍生物激活而成的核激素受體，主要參與降血脂血壓，抑制炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程[20]。有研究表明，PPARγ配體在人類中具有抗腫瘤作用，通過(guò)降低細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌、乳腺癌和結(jié)腸腺癌等惡性腫瘤的凋亡[21]。本研究GSEA分析顯示，與PPAR通路的基因集在CXCL5低表達(dá)組中富集。然而CXCL5與PPAR通路的關(guān)系還不清楚，仍需要更多的深入研究。

綜上，本研究通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)和生物信息學(xué)方法證實(shí)了CXCL5在腎透明細(xì)胞癌中潛在的診斷和預(yù)后價(jià)值，并探討了CXCL5在腎透明細(xì)胞癌中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，但仍有不足之處，由于生物信息學(xué)分析缺乏實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，有待后續(xù)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。