640 nm紅光照射對人真皮成纖維細胞增殖的時間劑量依賴性效應及對TGF-β相關基因mRNA表達的影響

易 斌 郭慶霞 何 軍 韓克影 凡靜靜

1.北京創盈光電醫療科技有限公司，北京 100176；2.北京勤邦生物技術有限公司，北京 102206

妊娠紋是由于孕期腹部隆起后皮膚出現的波浪狀花紋，分娩后花紋逐漸消失形成有光澤的瘢痕線紋，即妊娠紋[1]。妊娠紋嚴重影響女性的皮膚美觀，因此受到社會廣泛的關注。妊娠紋的治療主要包括藥物治療、激光治療、微創手術治療、紅光治療等[2-3]，但是目前無明確的治療方法。妊娠紋產生的機制涉及內分泌調控、遺傳基因易感性以及表皮細胞的增殖等[4-5]，但是最終的調控核心是皮膚中膠原纖維和彈力纖維的減少及斷裂[6-7]。皮膚被拉伸形成妊娠紋的過程中，拉伸力使成纖維細胞收縮衍變成肌纖維母細胞[8]。妊娠紋的肌纖維母細胞處于靜止狀態，不能合成膠原蛋白和彈性蛋白[9-10]。因此妊娠紋的治療主要調控成纖維細胞促進膠原纖維和彈性纖維的表達。紅色光波一般介于600～700 nm，紅光治療主要依賴光化學作用，而不是能量作用[3]。目前紅光治療主要應用于消炎、加速組織修復、促進骨折愈合、淡化瘢痕等領域[11-12]。640 nm主要應用于皮膚治療領域。妊娠紋是皮膚損傷后留下的痕跡[13]，而640 nm紅光治療妊娠紋的作用機制不明確。本研究將采用不同強度（時間）的640 nm紅光照射人真皮成纖維細胞，檢測細胞的增殖和凋亡，同時檢測轉化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）、膠原（collagen，Col）、Smad2和Smad3的基因表達，為640 nm紅光治療妊娠紋提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞 人真皮成纖維細胞（SCIENCEL）

1.1.2 實驗試劑 成纖維細胞培養基（諾唯贊生物科技股份有限公司，R401-01）、吉姆薩染色液（索萊寶，G1015）、臺酚藍染色液（索萊寶，C0040）、胰酶 -EDTA（索萊寶，T1300）、噻唑藍（GIBICO，M6494）、Trizol（ThermoFisher，15596026）、反轉錄試劑盒（ThermoFisher，4368813）、ABsolute Blue QPCR Mix、SYBR Green、Low ROX（ThermoFisher，AB4323A），其他化學試劑為國藥產品。

1.1.3 實驗材料 6孔板（康寧）、96孔板（康寧）、PCR八連管。

1.1.4 實驗儀器 二氧化碳培養箱（SANYO，MC0-15AC）、生物安全柜（海爾，HR40-IIA2）、離心機（北京時代北利離心機公司，D75-2B）、酶標儀（Thermo Fisher，MULTISKAN FC）、顯微鏡（北極光普佳科技有限公司，IM200）、PCR儀（北京東勝創新生物科技有限公司，ETC811）、熒光定量PCR儀（ABI，Step One）。

1.2 方法

1.2.1 細胞復蘇及傳代 復蘇的細胞37℃水浴鍋中輕晃融化，轉入含有10 ml DMEM的離心管；1000 r/min離心5 min，倒掉上清液后，離心管中加培養基混懸后轉移至培養瓶；細胞增殖到80%密度傳代。

1.2.2 細胞照射 待細胞培養至第三代后，分組進行640 nm、25 mW/cm2紅光照射，分別以不同的照射時間（30、60、120 min）對培養孔進行非重疊照射，每天照射一次，同時設定無照射組進行對照比較。照射不同時間后，繼續培養細胞，于 12、24、36、48、60、72 h收集細胞進行細胞活性、細胞數量和基因表達水平的檢測。

1.2.3 熒光染色 細胞爬片用PBS浸洗3次，3 min/次；用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗 3次，3 min/次；0.5% TritonX-100透化 20 min，PBS浸洗3次，3 min/次；山羊血清室溫封閉30 min，一抗（Vimentin）4℃孵育過夜；PBST浸洗3次，3 min/次，熒光（Cy3）標記羊抗兔 IgG，孵育 1 h，PBST浸洗3次，3 min/次；DAPI復染核后封片，并觀察采集圖像。

1.2.4 噻唑藍（MTT）檢測 細胞培養1 d后，640 nm紅光照射分別照射30、60、120 min；對輻照后每組的 12、24、36、48、60、72 h 時間段進行檢測，棄掉上清，添加5 mg/ml無菌MTT溶液20 μl，繼續培養4 h。終止培養，吸棄孔內培養上清溶液，每孔添加150 μl無菌DMSO溶液，震蕩10 min左右，使結晶物充分溶解。檢測490 nm波長處吸光光度值，根據讀數判斷細胞增殖速度。

1.2.5 吉姆薩染色 細胞接種在六孔板的蓋玻片，培養3 d后甲醇固定10 min，蒸餾水浸洗2次，3 min/次；滴加稀釋好的吉姆薩染色液室溫染色15～30 min；自來水緩慢沖洗晾干后鏡檢。

1.2.6 臺酚藍染色 細胞接種在六孔板，培養3 d后消化細胞制成細胞懸液；細胞懸液與0.4%臺酚藍溶液（9∶1）混勻，染色3～10 min；吸取少量染色細胞，用血細胞計數板計數。細胞存活率=活細胞總數/（活細胞總數+死細胞總數）×100%。

1.2.7 實時熒光定量PCR（Quantitative Realtime PCR，RT-PCR）法檢測 目的基因RT-PCR收集細胞，加入500 μl TRIZOL提取RNA，按照反轉錄試劑盒將RNA轉錄成cDNA，-20℃保存備用。目的基因擴增，配制RT-PCR反應液：2×mastermix（10.0 μl）、ForwardPrimer（1.0 μl）、ReversePrimer（1.0 μl）、Nuclease-free H2O（6.0 μl）。將 PCR 反應液分裝于PCR八連管中，18 μl/管；加入2 μl制備好的cDNA；在熒光定量PCR儀上進行程序擴增（表1），檢測基因的表達差異。基因溶解曲線用來指示擴增產物的特異性，基因循環數計算基因表達的相對含量。

2 結果

2.1 人真皮成纖維細胞的鑒定

熒光染色后，Vimentin染色陽性率＞90%，即細胞純度＞90%，見圖1。

圖1 人真皮成纖維細胞熒光鑒定結果

2.2 不同強度的640 nm紅光照射對人真皮成纖維細胞周期的影響

2.2.1 不同強度的640 nm紅光照射對人真皮成纖維細胞增殖的影響 MTT實驗結果顯示，同對照組相比，30、60、120 min的照射強度在細胞生長的前期對細胞的活性影響不顯著，但在細胞生長對數期影響顯著，對照組和照射組均在生長60 h時達到了細胞活性的最高點，且照射組細胞活性顯著高于對照組，照射120 min比照射30、60 min細胞活性更高。見圖2。

圖2 MTT活性檢測細胞生長曲線圖

2.2.2 不同強度的640 nm紅光照射對人真皮成纖維細胞細胞形態及數量的影響 吉姆薩細胞染色結果顯示，每組的細胞形態、狀態良好，無顯著差異，染色細胞密度顯示30、60、120 min照射組細胞密度要大于對照組。見圖3。

圖3 各組培養不同時間染色

2.2.3 不同強度的640 nm紅光照射對人真皮成纖維細胞生長周期的影響 36 h后照射組細胞數量顯著多于對照組，且細胞生長60 h后逐漸進入細胞凋亡期，而對照組生長72 h還未進入細胞增殖的凋亡期，見圖4。通過對細胞存活率計算，對照組無死亡細胞，而照射組細胞存活率下降，不同照射強度之間細胞存活率無顯著差異，見圖5。

圖4 細胞計數生長曲線

圖5 培養72 h后細胞存活率

2.3 不同強度的640 nm紅光照射對人真皮成纖維細胞基因表達的影響

2.3.1 不同強度的640 nm紅光照射對人真皮成纖維細胞TGF-β基因表達的影響 各組人真皮成纖維細胞TGF-β基因表達的比較，照射組48 h之前與對照組相比，TGF-β基因的表達降低，48 h之后表達逐漸升高，且照射60 min上調作用最為顯著。見圖6。

圖6 不同照射強度對人真皮成纖維細胞TGF-β基因表達的影響

2.3.2 不同強度的640 nm紅光照射對人真皮成纖維細胞COL基因表達的影響 同對照組相比，30 min和60 min照射組細胞COL基因表達升高，且其表達趨勢與對照組一致，而120 min照射組與對照組相比也顯著上調了細胞COL基因表達，且在照射48 h時細胞COL基因表達達到最高值，之后出現急劇下降。見圖7。

圖7 不同照射強度對人真皮成纖維細胞COL基因表達的影響

2.3.3 不同強度的640 nm紅光照射對人真皮成纖維細胞Smad-2、Smad3基因表達的影響 不同強度640 nm紅光照射對人真皮成纖維細胞Smad2基因的影響實驗結果顯示，照射30 min對人真皮成纖維細胞Smad2基因的表達無顯著影響；照射60 min時，細胞生長24 h時Smad2基因的表達達到高峰；而照射120 min時，細胞生長12 h和24 h時Smad2基因的表達均顯著高于對照組，36 h時達到最高點，之后開始急劇下降，可能是120 min照射強度增加了細胞毒效應。見圖8。

圖8 不同照射強度對人真皮成纖維細胞Smad2基因表達的影響

Smad3基因的表達結果顯示，照射30 min和60 min，人真皮成纖維細胞Smad3基因表達上調；120 min照射組在細胞生長前期Smad3基因表達顯著上調，48 h之后表達明顯低于對照組，可能是120 min照射強度增加了細胞毒效應；照射60 min細胞生長周期內一直顯著高于對照組。見圖9。

圖9 不同照射強度對人真皮成纖維細胞Smad3基因表達的影響

3 討論

妊娠紋是由于女性懷孕過程膠原纖維牽拉斷裂形成的皮膚瘢痕線紋，妊娠紋的發生率高達60%～90%，影響著大約4億女性的正常生活[14]。妊娠紋的發生機制核心是膠原纖維和彈性纖維的減少，而成纖維細胞是其主要來源細胞[15]。因此，上調成纖維細胞的活性，促進膠原纖維和彈性纖維的生成是治療妊娠紋的關鍵途徑。妊娠紋的治療方法包括藥物治療、手術治療、激光治療、射頻治療和紅光治療等[12，16]。640 nm紅光屬于中波段紅光，其治療妊娠紋的作用強度和對成纖維細胞的調控機制依舊不明確。所以，本研究選用不同強度的640 nm紅光照射人真皮成纖維細胞，探究紅光照射對細胞周期的影響以及對成纖維細胞基因表達的調控機制。

不同強度640 nm紅光照射指數期的成纖維細胞，每隔12 h進行細胞活性及表達因子基因的檢測，檢測至照射后72 h。實驗結果顯示，與對照組相比，640 nm紅光照射顯著上調細胞的增殖活性和細胞數量。640 nm紅光照射能促進成纖維細胞的增殖，從而增加生成膠原的細胞數量，促進膠原的產生，膠原的產生能修復妊娠紋。MTT活性結果顯示，照射組細胞均在60 h時達到細胞生長的穩定期，72 h之后進入衰亡期，而對照組的MTT活性、細胞計數以及細胞存活率結果顯示，對照組在60 h進入穩定期，72 h還未進入衰亡期，本實驗結果表明640 nm紅光照射可顯著提升細胞的增殖活性，縮短細胞的生長周期。640 nm紅光照射組和對照組細胞因子基因表達檢測結果顯示，640 nm紅光照射顯著上調了人真皮成纖維細胞TGF-β的表達，同時調控了膠原蛋白基因的表達上調，且照射60 min對細胞的增殖活性作用最顯著。本研究需要進一步完善紅光照射誘導膠原纖維生成的分子調控機制，為紅光治療妊娠紋提供強有力的理論基礎。

綜上，在本實驗中發現640 nm紅光照射療法具有時間和劑量依賴性。60 min的紅光照射時長，照射效應積累48～60 h時即可顯著促進體外培養的人真皮成纖維細胞的增殖活性。本研究結果為640 nm紅光治療妊娠紋提供了理論基礎。