龍膽瀉肝丸（濃縮丸）現(xiàn)行質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的提高研究

李占芳 李俊卿 宋建建 巴小翠 李 媛 許 偉

山東省東營(yíng)市食品藥品檢驗(yàn)中心，山東東營(yíng)257091

龍膽瀉肝丸（濃縮丸）由龍膽、柴胡、黃芩、梔子（炒）、澤瀉、木通、車前子（鹽炒）、當(dāng)歸（酒炒）、地黃、甘草（蜜炙）10味藥材組成，具有清肝膽、利濕熱的作用[1]。臨床上主要用于肝膽濕熱，頭暈?zāi)砍啵Q耳聾，耳腫疼痛，脅痛口苦，尿赤澀痛，濕熱帶下的治療[2]。中藥成方制劑的臨床療效是各成分的共同作用，龍膽為君藥，可以清下焦?jié)駸帷⑶甯文憣?shí)火；梔子、黃芩為臣藥，助龍膽清瀉肝火；澤瀉、木通和車前子清下焦?jié)駸幔坏攸S、當(dāng)歸補(bǔ)陰血；柴胡疏肝；甘草調(diào)和諸藥。龍膽瀉肝丸（濃縮丸）現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，主要檢測(cè)項(xiàng)目為顯微鑒別和薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）鑒別[1]，而對(duì)其他藥材的鑒別和含量測(cè)定均未作規(guī)定，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較為簡(jiǎn)單。為了進(jìn)一步有效控制該制劑的質(zhì)量水平，本研究對(duì)現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提高和完善，主要針對(duì)各藥材的薄層色譜鑒別和含量測(cè)定進(jìn)行研究，增加當(dāng)歸、甘草的薄層色譜鑒別，建立龍膽、黃芩、梔子3味藥材中龍膽苦苷、黃芩苷和梔子苷的含量測(cè)定。報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 島津LC-20AT高效液相色譜儀（二極管陣列檢測(cè)器）（日本島津制作所，出廠編號(hào)：L20154970517US）；梅特勒XS205DU電子分析天平（瑞士梅特勒，出廠編號(hào)：1128491122）。

1.1.2 試劑及藥材 樣品：龍膽瀉肝丸（濃縮丸）（A 公司批號(hào)分別為 0041001、0041002、9041002；B 公司批號(hào)分別為 200307、200404、200401）；對(duì)照藥材和對(duì)照品：當(dāng)歸（中國(guó)食品藥品檢定研究院，120927-201516）、甘草（中國(guó)食品藥品檢定研究院，120904-201511）、龍膽苦苷（中國(guó)食品藥品檢定研究院，110720-201918）、黃芩苷（中國(guó)食品藥品檢定研究院，110715-201821）、梔子苷（中國(guó)食品藥品檢定研究院，110749-201919）；試劑與耗材：甲醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20191224）、乙腈（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20200303）均為色譜純；硅膠G薄層板（德國(guó)默克薄層層析板）；磷酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20181025）為優(yōu)級(jí)純，其他試劑為分析純，水為實(shí)驗(yàn)室自制純化水。

1.2 方法

1.2.1 當(dāng)歸的薄層色譜鑒別方法 取本品適量，研細(xì)，稱取約0.5 g，加甲醇30 ml，加熱回流30 min，過(guò)濾，濾液蒸干，用20 ml水溶解殘?jiān)檬兔眩?0～90℃）提取3次，每次25 ml，合并石油醚液，石油醚液蒸干（水液留存，用于甘草的薄層色譜鑒別樣品溶液的制備），加乙醇0.5 ml使殘?jiān)芙猓鳛闃悠啡芤海涣砣‘?dāng)歸對(duì)照藥材0.5 g，同樣品溶液制備方法，制成當(dāng)歸對(duì)照藥材溶液；按龍膽瀉肝丸（濃縮丸）制法[1]，制成缺當(dāng)歸的陰性樣品，同樣品溶液制備方法，制成缺當(dāng)歸陰性樣品溶液。按《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版四部通則0502項(xiàng)下操作[3]，樣品溶液和缺當(dāng)歸陰性樣品溶液的點(diǎn)樣量均為5 μl，當(dāng)歸對(duì)照藥材溶液點(diǎn)樣量為2 μl，展開劑為正己烷∶乙酸乙酯（7.5∶2.5），展開于硅膠G薄層板上。在紫外光（365 nm）燈下觀察。

1.2.2 甘草的薄層色譜鑒別方法 取“1.2.1”項(xiàng)下的水液，以乙酸乙酯為提取液，振搖提取2次，每次20 ml，棄去乙酸乙酯液，取水液，用正丁醇振搖提取3次，每次20 ml，合并正丁醇液，蒸干，加乙醇1 ml使殘?jiān)芙猓鳛闃悠啡芤海涣砣「什輰?duì)照藥材1.0 g，同樣品溶液制備方法制成甘草對(duì)照藥材溶液；按龍膽瀉肝丸（濃縮丸）制法[1]，制成缺甘草的陰性樣品，同樣品溶液制備方法制成缺甘草陰性樣品溶液；按《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版四部通則0502項(xiàng)下操作[3]，樣品溶液和缺甘草陰性樣品溶液點(diǎn)樣量均為5 μl，甘草對(duì)照藥材溶液點(diǎn)樣量為2 μl，展開劑為三氯甲烷∶甲醇∶水（30∶12∶3）的下層溶液，展開于硅膠G薄層板上，以5%香草醛硫酸溶液為顯色劑，110℃加熱，使斑點(diǎn)顯色清晰。

1.2.3 龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷的含量測(cè)定方法1.2.3.1 色譜條件 色譜柱：資生堂C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速 1.0 ml/min，柱溫25℃，進(jìn)樣量10 μl，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，流動(dòng)相為甲醇（A）-0.3%磷酸溶液（B），進(jìn)行梯度洗脫，見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.2.3.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取適量龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 ml含龍膽苦苷80 μg、梔子苷60 μg、黃芩苷170 μg的混合對(duì)照溶液。

1.2.3.3 供試品溶液的制備 取本品適量，研細(xì)，約取0.5 g，精密稱定，置于50 ml錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 ml，密塞，精密稱定，置水浴上加熱回流50 min，放至室溫，用50%甲醇補(bǔ)足重量，過(guò)濾，續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.2.3.4 陰性樣品溶液的制備 按龍膽瀉肝丸（濃縮丸）制法[1]制備缺龍膽、梔子、黃芩陰性樣品，按“1.2.3.3”項(xiàng)下方法制成陰性樣品溶液。

1.2.3.5 方法學(xué)考察

1.2.3.5.1 專屬性試驗(yàn) 取“1.2.3.2”“1.2.3.3”“1.2.3.4”項(xiàng)下3種溶液各10 μl，按“1.2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3.5.2 線性關(guān)系考察 取“1.2.3.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照溶液，精密量取 2、2.5、5、7.5、10 ml分別置于10 ml量瓶中，分別加入50%甲醇，稀釋至刻度，搖勻，按“1.2.3.1”項(xiàng)下的方法測(cè)定，以峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析。

1.2.3.5.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取“1.2.3.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算3個(gè)成分峰面積的RSD。

1.2.3.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“1.2.3.3”項(xiàng)下制備同一供試品溶液，分別于 0、4、8、12、16、24 h 進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算3個(gè)成分峰面積的RSD。

1.2.3.5.5 重復(fù)性試驗(yàn) 按“1.2.3.1”項(xiàng)下方法，取同一供試品，平行制備6份樣品溶液，取6份樣品溶液的測(cè)定結(jié)果，計(jì)算其RSD。

1.2.3.5.6 回收率試驗(yàn) 取同一樣品（A公司，批號(hào)為0041001），平行取6份，精密稱定，分別置于100 ml錐形瓶中，分別加入龍膽苦苷0.468 4 mg、梔子苷 0.3641 mg、黃芩苷 0.9754 mg，按“1.2.3.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按“1.2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3.5.7 含量測(cè)定 取本品樣品6批，按“1.2.3.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，每批制備兩份，按“1.2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸的薄層色譜鑒別結(jié)果與分析

按照“1.2.1”的方法操作，在紫外光（365 nm）燈下觀察，見圖1。在供試品色譜中，陰性對(duì)照無(wú)干擾，供試品與對(duì)照藥材色譜在相同的位置上顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

圖1 當(dāng)歸的薄層色譜鑒別結(jié)果

2.2 甘草的薄層色譜鑒別結(jié)果與分析

按照“1.2.2”的方法操作，110℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，見圖2。在供試品色譜中，陰性對(duì)照無(wú)干擾，供試品與對(duì)照藥材色譜在相同的位置上顯示相同顏色的斑點(diǎn)。

圖2 甘草的薄層色譜鑒別結(jié)果

2.3 龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷含量測(cè)定的結(jié)果與分析

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 按照“1.2.3.5.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，得混合對(duì)照品、樣品和陰性對(duì)照高效液相色譜圖，結(jié)果見圖3～5。從各色譜圖中可以看出，陰性無(wú)干擾，各成分峰型均較好，各峰均完全分離，達(dá)到分離度的要求，此條件適合用于龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷的含量測(cè)定。

圖3 混合對(duì)照色譜圖

圖4 樣品色譜圖

圖5 缺龍膽、梔子和黃芩陰性樣品色譜圖

2.3.2 線性關(guān)系考察 按照“1.2.3.5.2”方法測(cè)定，以峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見表2。龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷的r值均＞0.9995，說(shuō)明在線性范圍內(nèi)，龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷對(duì)照品的質(zhì)量濃度與峰面積的線性關(guān)系良好。

表2 龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷的回歸方程

2.3.3 精密度試驗(yàn) 按照“1.2.3.5.3”方法測(cè)定，分別計(jì)算龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷峰面積的RSD，見表3。龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷峰面積的RSD均＜1%，該方法符合精密度試驗(yàn)要求，也說(shuō)明儀器精密度符合規(guī)定要求。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按照“1.2.3.5.4”方法測(cè)定，計(jì)算龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷峰面積的RSD，見表3。龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷峰面積的RSD均＜1.5%，說(shuō)明處理后樣品溶液中的龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定，無(wú)降解等反應(yīng)發(fā)生。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 按照“1.2.3.5.5”方法測(cè)定，根據(jù)6份樣品的測(cè)定結(jié)果計(jì)算RSD，見表3。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

表3 龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD結(jié)果（%）

2.3.6 回收率試驗(yàn) 按照“1.2.3.5.6”方法測(cè)定，龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷的平均回收率分別為99.2%、98.7%、97.9%，RSD分 別 為 1.05%，0.87%，1.13%（n=6）。結(jié)果表明該方法回收率高，方法可行。

2.3.7 樣品含量測(cè)定 按照“1.2.3.5.7”方法測(cè)定，計(jì)算含量，測(cè)定結(jié)果見表4。從結(jié)果可以看出，不同廠家的樣品或相同廠家不同批次的樣品，龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷的含量差別較大，說(shuō)明藥材不同批次的質(zhì)量差異較大，需進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制。

表4 樣品含量結(jié)果（mg/g）

3 討論

3.1 薄層色譜定性鑒別

通過(guò)參考文獻(xiàn)[4-8]，比較甲醇、乙醇、50%乙醇和乙酸乙酯等不同的提取溶劑，考察了30 min回流和60 min回流、30 min超聲和60 min超聲等不同的提取方法，最終確定甲醇為提取溶劑，30 min回流的提取效果最好；同時(shí)考察了不同體系的展開劑，最終確定當(dāng)歸的展開劑為正己烷∶乙酸乙酯（7.5∶2.5）時(shí)，甘草的展開劑為三氯甲烷∶甲醇∶水（30∶12∶3）的下層溶液時(shí)，展開效果最好。本研究同時(shí)研究了柴胡和澤瀉兩種藥材的薄層色譜鑒別，但因這兩種藥材的陰性均有干擾，未找到合適的提取、展開和分離方法，未能建立柴胡和澤瀉的薄層色譜鑒別方法。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

3.2.1 波長(zhǎng)和流動(dòng)相的選擇 參照《中華人民共和國(guó)藥典》龍膽瀉肝丸水丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[2]，考察了254、277、240 nm三個(gè)波長(zhǎng)，254 nm波長(zhǎng)下，龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷三種成分的峰形最好、回收率高、重復(fù)性好、分離也最好，最終選擇了254 nm作為三種成分的檢測(cè)波長(zhǎng)。依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)方法和報(bào)道[9-20]，本文比較了甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液、甲醇-0.3%磷酸溶液、乙腈-0.3%磷酸溶液進(jìn)行梯度洗脫的效果，通過(guò)比較，發(fā)現(xiàn)以甲醇-0.3%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷三種成分的峰形最好、回收率高、重復(fù)性好、分離也最好。最終確定以甲醇-0.3%磷酸溶液為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫。

3.2.2 提取條件的選擇 在含量測(cè)定試驗(yàn)中，本文對(duì)不同的提取溶劑（水、50%甲醇、甲醇、50%乙醇、乙醇），超聲提取時(shí)間（0、30、40、60 min），回流提取時(shí)間（0、30、40、60 min）進(jìn)行比較，結(jié)果表明 50% 甲醇、回流提取40 min處理供試品時(shí)提取效果最好，最終確定以50%甲醇、回流提取40 min處理供試品。

4 小結(jié)

本研究建立了龍膽瀉肝丸（濃縮丸）中甘草和當(dāng)歸的薄層色譜鑒別方法，建立了龍膽瀉肝丸（濃縮丸）中龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷3種成分含量的高效液相色譜法測(cè)定方法，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性好、精密度高。結(jié)果顯示不同廠家的樣品之間、相同廠家不同批次的樣品之間，其龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷的含量存在較大差異，特別是龍膽苦苷和黃芩苷，差異可達(dá)2～4倍，存在質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)。建議提高該制劑濃縮丸的標(biāo)準(zhǔn)，以便更好地控制其質(zhì)量。龍膽瀉肝丸（濃縮丸）為復(fù)方制劑，由10味藥材組成，濃縮丸中各成分提取比較困難，本研究只對(duì)其中當(dāng)歸、甘草、龍膽、梔子和黃芩五種藥材的成分建立了質(zhì)量控制，而柴胡、澤瀉、木通、車前子、地黃五種成分還未能建立合理有效的質(zhì)量控制的方法，需要進(jìn)一步研究提高。