UPLC-MS/MS法測定炮制前后款冬花中款冬堿的含量

昝 珂 李耀磊 王丹丹 金紅宇 馬雙成 劉麗娜* 王 瑩*

1.中國食品藥品檢定研究院，北京 102629；2. 北京中醫藥大學中藥學院，北京 102488

款冬花為菊科植物款冬(TussilagofarfaraL.)的干燥花蕾，別名冬花，主要分布于甘肅、陜西、山西及河南等地區[1]。現代臨床多用于新久咳嗽，喘咳痰多，勞嗽咳血的治療，療效顯著。臨床多用蜜炙品(蜜款冬花)，中醫認為，蜂蜜炮制款冬花能夠增強止咳化痰、潤肺下氣的功效[2]。款冬花中含有吡咯里西啶生物堿類成分，款冬堿是從款冬花中分離得到的一種吡咯里西啶生物堿類成分[3]。1,2-不飽和的吡咯里西啶生物堿具有肝毒性，但款冬堿是飽和的吡咯里西啶生物堿(結構式見圖1)，不具有肝毒性[4]。吡咯里西啶生物堿類成分往往具有抗菌、抗膽堿等藥理作用[5]。款冬堿至今僅在少數幾個植物中有報道[6]，具有較強的專屬性，含量測定至今未見報道。本文建立UPLC-MS/MS法，同時測定蜜炙前后的款冬花中款冬堿的含量，對其炮制前后含量的變化進行比較。

圖1 款冬堿的結構式

1 儀器與材料

H-CLASS超高效液相色譜儀(沃特世)；三重四極桿串聯質譜檢測器(沃特世)；R-210型旋轉蒸發儀(Buchi公司)；KQ-3200DV型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，Quintix125D-1CN電子分析天平(賽多利斯公司)。Oasis MCX固相萃取小柱(150 mg/6 cc，沃特世公司)。

對照品款冬堿(批號：11782)由上海欽誠生物科技有限公司提供；純度大于98%；乙腈、甲醇、甲酸和甲酸銨均為質譜級(Fisher)，屈臣氏超純水，其他試劑為分析純。

款冬花采自甘肅省，經中檢院昝珂副研究員鑒定為菊科植物款冬TussilagofarfaraL.的干燥花蕾。每批樣品分為2份，一份為生品(編號分別標記為S1～S4)，另一份按照《中國藥典》通則規定，照蜜炙法用蜜水炒至不粘手(編號分別標記為Z1～Z4)。

2 方法與結果

2.1 色譜、質譜條件 色譜柱：Waters CORTECS UPLC C18(100 mm × 2.1 mm, 1.6 μm)；柱溫：40 ℃；流動相：0.05%甲酸水溶液(A)及含0.05%甲酸的乙腈(B)(4∶1)；流速：0.3 mL·min-1；進樣體積：2 μL。質譜離子源為電噴霧離子化源(ESI)；正離子多反應監測模式(MRM)；毛細管電壓3.0 kV；離子源溫度150 ℃；去溶劑溫度500 ℃。款冬堿對照品溶液進樣后得到準分子離子峰m/z200.20[M+H]+(圖2)；準分子離子峰經子離子掃描，得到主要碎片為m/z57.03和m/z83.18(圖3)，選定m/z57.03為定量離子，m/z83.18為定性離子。經手動優化錐孔電壓和碰撞電壓，錐孔電壓為24 V，定量離子碰撞電壓為30 V，定性離子碰撞電壓為36 V。對照品及樣品的色譜圖如圖4所示。

圖2 款冬堿正離子模式下質譜圖

圖3 款冬堿正離子模式下子離子掃描質譜圖

圖4 對照品溶液(A)和供試品溶液(B)MRM色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取款冬堿適量，用10%乙腈水溶解配成濃度分別為1.005 μg·mL-1的對照品儲備液。精密量取對照品儲備液適量，用10%乙腈水配成濃度為20.10 ng·mL-1的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取款冬花粉末1.0 g，精密稱定，加入 0.05 mol·L-1硫酸溶液40 mL，超聲提取 (300 W， 40 kHz)30 min，過濾，取濾液20 mL進行固相萃取富集純化。具體流程為甲醇5 mL活化SPE-PCX小柱，0.05 mol·L-1硫酸溶液5 mL平衡小柱，將硫酸溶液樣品20 mL上柱，甲醇10 mL淋洗除雜， 8%氨水-甲醇溶液10 mL洗脫，收集洗脫液并濃縮至1 mL左右，用10%乙腈水稀釋定容至100 mL量瓶中，過0.22 μm微孔濾膜，取續濾液，即為供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系和靈敏度考察 分別精密吸取對照品儲備液0.1、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0 mL，置100 mL量瓶中，加10%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，按照“2.1”項下的條件進行測定。以對照品的峰面積為Y，對應的濃度為X進行線性回歸。款冬堿的回歸方程為Y= 23621X-1876，相關系數r=0.9993，表明款冬堿的線性關系良好。以定量離子對的色譜峰信噪比S/N≥3對應的最低濃度為檢測限(LOD)，以定量離子對色譜峰信噪比S/N≥10對應的最低濃度為定量限(LOQ)，檢測限為0.10 ng·mL-1， 定量限為0.30 ng·mL-1。

2.3.2 精密度試驗 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液1 μL，連續進樣6次，記錄峰面積。結果款冬堿的峰面積的RSD為2.35%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩定性試驗 取同一份供試品溶液(S1)，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣測定。結果款冬堿的峰面積的RSD (n=6)為2.62%，結果表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.3.4 重復性試驗 按照“2.2.2”項下方法制備樣品(S1)溶液6份，分別進樣測定。結果款冬堿的平均含量分別為20.76 μg·g-1，RSD (n=6)為2.87%，表明該方法的重復性良好。

2.3.5 加樣回收試驗 取款冬堿對照品適量，精密稱定，置量瓶中，加10%乙腈水溶解配制成質量濃度分別為10.05 μg·mL-1的對照品溶液。取已知含量的供試品粉末(S1)6份，每份各約0.5 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，分別精密加入上述對照品溶液各1.0 mL，按照“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液，進樣分析，計算回收率。結果見表1。

表1 款冬堿加樣回收試驗結果

2.4 含量測定 分別準確稱取不同產地的款冬花藥材1.0 g，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進樣測定，依據外標法計算款冬堿的含量。結果見表2。

表2 款冬花炮制前后款冬堿的含量測定結果 (μg·g-1, n=2)

3 討論

3.1 檢測方法的選擇 款冬堿為款冬花中特征性的吡咯里西啶生物堿類成分，為痕量成分，采用高靈敏度的UPLC-MS/MS法為首選方法。本實驗采用UPLC-MS/MS法同時測定，正離子多反應監測被測成分的離子對，靈敏度高，定量離子峰形好，其他物質無干擾，能夠對待測物質準確測定。

3.2 流動相的選擇 本研究考察了不同配比乙腈-水以及含有甲酸、甲酸銨等含酸溶液作為流動相對吡咯里西啶生物堿的分離能力的影響。通過調節流動相比例，通過預實驗最終確定流動相為含0.05%甲酸的水溶液及含0.05%甲酸的乙腈(4∶1)恒流洗脫，在該系統下能夠對款冬堿達到定量測定的要求。

3.3 定量分析結果 本文采用建立的UPLC-MS/MS法對炮制前后款冬花中的款冬堿的含量進行的測定，炮制對款冬花中款冬堿的含量具有明顯影響，炮制后款冬堿呈明顯的下降趨勢，下降的成分是否轉化為其他物質需要進一步研究。