金錢膽通顆粒質量標準提升研究

彭政忠 唐靖雯 潘 梅 楊 桃 潘 婷 盧禮平 王 歡

貴州威門藥業(yè)股份有限公司，貴州 貴陽 550018

金錢膽通顆粒是由貴州威門藥業(yè)股份有限公司生產的全國獨家劑型專利品種，由連錢草、金錢草、茵陳、虎杖、柴胡、蒲公英、醋香附、丹參、決明子、烏梅10味中藥組成。具有清利濕熱、疏通肝膽、止痛排石的功效，用于膽石癥濕熱郁結于少陽膽附之脅痛。痛在右脅，固定不移，或繼發(fā)絞痛，上引肩背、便秘尿黃，甚至身目俱黃發(fā)熱，舌質暗紅，苔厚膩或黃膩，脈弦滑或弦緊。金錢膽通顆粒批準文號為國藥準字Z20163050，現行標準為國家藥品標準YBZ00252016[1]；現收載于《國家基本醫(yī)療保險、工傷保險和生育保險藥品目錄(2019年版)》、《國家基本藥物目錄(2018版)》、《國家基本藥物臨床應用指南(2018年版)》?，F行標準中薄層鑒別、含量測定方法專屬性、重復性較差，不能有效控制產品質量。本研究在現行質量標準基礎上，優(yōu)化了金錢草、茵陳、虎杖、決明子、丹參、柴胡薄層鑒別方法，增加了以虎杖苷為指標性成分的含量測定方法。研究后建立的方法簡便易行、專屬性強、重復性好，可為該制劑質量標準的提升提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC-20AD高效液相色譜儀(PDA檢測器)；ZF-2型三用紫外儀(上海市安亭電子儀器廠)；CH-250型超聲波清洗機(天津恒奧科技公司)；；AG135型電子天平(梅特勒-托利多公司)。

1.2 材料 金錢草對照藥材(批號：121187-201403)、茵陳對照藥材(批號：121555-201602)、虎杖對照藥材(批號：120980-201706)、丹酚酸B對照品(批號：111562-201716)、橙黃決明素對照品(批號：111900-201605)、虎杖苷對照品(批號：111575-201603；純度：87.3%；批號：111575-200502)均購于中國食品藥品檢定研究院；柴胡皂苷b2對照品(批號：7383，上海詩丹德標準技術服務有限公司)。硅膠G板(批號：20150701，青島海洋化工廠分廠)，娃哈哈純凈水，乙腈(ACN)是色譜純，其它試劑均為分析純。

金錢膽通顆粒(批號：190302、190303、190402、190501、190801、190802、190804、190901、190902、190903)，由貴州威門藥業(yè)股份有限公司提供。

2 方法與結果

2.1 薄層鑒別 在現行標準YBZ00252016的基礎上進行了金錢膽通顆粒質量標準提高研究，對處方中的金錢草、茵陳、虎杖、決明子、丹參、柴胡薄層鑒別進行了修訂，優(yōu)化了金錢草薄層鑒別的供試品制備方法，采用超聲法替代冷浸法，并采用過柱除雜，既提高檢驗效率又提高了相應斑點的清晰度，如圖1A所示；優(yōu)化了茵陳薄層鑒別的供試品制備方法，并用常規(guī)試劑二氯甲烷替代易制毒試劑三氯甲烷，提高了方法的專屬性，如圖1B所示；優(yōu)化了虎杖的薄層鑒別方法，用虎杖對照藥材、虎杖苷為對照，建立了虎杖專屬鑒別項，如圖1C所示；優(yōu)化了決明子的薄層鑒別方法，用橙黃決明素為對照，建立了決明子專屬鑒別項，如圖1D所示；優(yōu)化了丹參的薄層鑒別方法，刪除了以原兒茶醛、丹參對照藥材為對照的丹參鑒別項，建立以丹酚酸B為對照的丹參薄層鑒別，提高了方法的專屬性，如圖1E所示；優(yōu)化了柴胡薄層鑒別的供試品制備方法，用常規(guī)試劑二氯甲烷替代易制毒試劑三氯甲烷，刪除了柴胡對照藥材，建立以柴胡皂苷b2 為對照的柴胡薄層鑒別，提高了方法的專屬性。如圖1F所示。

A：1～3.供試品溶液；4.陰性樣品溶液；5.金錢草對照藥材溶液。B：1～3.供試品溶液；4.陰性樣品溶液；5.茵陳對照藥材溶液。C：1～3.供試品溶液；4.陰性樣品溶液；5.虎杖對照藥材溶液；6.虎杖苷對照品溶液。D：1～3.供試品溶液；4.陰性樣品溶液；5.橙黃決明素對照品溶液。E：1～3.供試品溶液；4.陰性樣品溶液；5.丹酚酸B對照品溶液。F：1～3.供試品溶液；4.陰性樣品溶液；5.柴胡皂苷b2對照品溶液。圖1 金錢膽通顆粒薄層色譜圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Ultimate XB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相A、B分別為乙腈、0.1%磷酸溶液，按表1中的規(guī)定進行梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：306 nm；理論板數按虎杖苷峰計算不得低于3000。

表1 流動相梯度洗脫

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 對照品溶液 取虎杖苷對照品適量，精密稱定，加稀乙醇制成每1 mL含15 μg的溶液，即得。

2.2.2.2 供試品溶液 取金錢膽通顆粒(批號：190303)適量，混勻，研細，取約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W、頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2.3 缺虎杖的陰性樣品溶液 按處方量稱取缺虎杖的群藥，按照制備工藝的提取方法，制成陰性樣品，再按“2.2.2.2”項下方法制成陰性樣品溶液。

2.2.3 專屬性試驗 取“2.2.2”項下對照品溶液、供試品溶液、缺虎杖的陰性樣品溶液各10 μL，測定。結果顯示，陰性樣品無干擾。如圖2所示。

A.供試品溶液；B.對照品溶液；C.缺虎杖的陰性樣品圖2 金錢膽通顆粒專屬性試驗HPLC圖

2.2.4 線性關系考察 精密稱取虎杖苷對照品15.34 mg(批號：111575-200502，純度以89.5%計)，置于100 mL量瓶中，加稀乙醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.1373 mg/mL的對照品貯備液。分別精密吸取對照品儲備液1、3、4、5、12、25 mL置于50 mL量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，分別制成2.746、8.238、10.98、13.73、32.95、68.65 μg/mL系列濃度溶液，各進樣10 μL，測定峰面積。以虎杖苷進樣量(μg)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為y=4194351.38x-5277.46(r=1.0000，n=6)。結果表明：虎杖苷在0.02746～0.6865 μg范圍內線性關系良好。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取濃度為13.61 μg/mL的虎杖苷對照品溶液10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結果：峰面積的RSD為0.1%(n=6)，表明本方法精密度較好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.2.2”項下方法制備的供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件分析，分別在0、2、4、8、12、18、24 h測定，記錄色譜峰。結果：峰面積的RSD為0.3%(n=7)，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.2.7 重復性試驗 取同一批號樣品(批號：190303)6份，按“2.2.2.2”項下方法制成供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，以外標一點法計算虎杖苷的含量。結果：樣品中虎杖苷平均含量為1.292 mg/g，RSD為0.1%(n=6)，表明本方法的重現性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取虎杖苷對照品(批號：111575-200502，中國食品藥品檢定研究院)16.29 mg，置50 mL量瓶中，加稀乙醇適量使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.2916 mg/mL的虎杖苷對照品溶液Ⅰ。精密吸取虎杖苷對照品溶液Ⅰ15 mL，置25 mL量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.1750 mg/mL的虎杖苷對照品溶液Ⅱ。精密量取對照品溶液Ⅰ3 mL，置10 mL量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.08748 mg/mL的虎杖苷對照品溶液Ⅲ。

取已知含量的樣品(批號：190303，虎杖苷含量：1.292 mg/g)約0.15 g(共9份，分3組)，精密稱定，置25 mL容量瓶中，分別精密加入虎杖苷對照品溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ1 mL各3份，再分別加入稀乙醇定容至刻度，依照“2.2.2.2”項下方法制成供試品溶液，照“2.2.1”項下色譜條件進行測定，計算虎杖苷的回收率。結果：虎杖苷的平均回收率為102.8%，RSD為0.5%(n=9)。見表2。

表2 加樣回收試驗結果 (n=9)

2.2.9 樣品含量測定 取10批樣品，依照“2.2.2.2”項下方法制成供試品溶液，照“2.2.1”項下色譜條件進行測定，按外標法以峰面積計算供試品的含量，共計10批。見表3。

表3 10批樣品虎杖苷含量測定結果

3 討論

3.1 TLC色譜分析 原標準中金錢草薄層鑒別采用冷浸處理耗時較長，檢驗效率低。經摸索，采用超聲處理，再經氧化鋁柱洗脫除雜后，斑點清晰且檢驗效率提高。因此，以樣品超聲后經氧化鋁柱洗脫除雜作為金錢草薄層鑒別供試品制備方法。

原標準中采用大黃素、大黃酚為對照作為虎杖和決明子鑒別項，專屬性較差。經查閱文獻，虎杖中主要含有二苯乙烯類、蒽醌類及黃酮類等成分，其中二苯乙烯類中的虎杖苷和白藜蘆醇是虎杖的主要活性成分[2]，故選擇虎杖苷對照品作為虎杖的專屬性鑒別項。決明子的主要活性成分為蒽醌類成分，且含量較高。蒽醌類成分有大黃酚、大黃素甲醚、美決明子素、黃決明素、決明素、橙黃決明素、大黃素、蘆薈大黃素、意大利鼠李蒽醌-1-O-葡萄糖苷、1-去甲基橙黃決明素、黃決明素、2-O-β-D葡萄糖苷等[3]，且都有明顯的藥理活性，故選擇橙黃決明素對照品作為決明子的專屬性鑒別項。

原標準中丹參薄層鑒別以丹參對照藥材、原兒茶醛、丹酚酸B作為對照。經查閱文獻，丹參化學成分主要包括脂溶性成分和水溶性成分，水溶性成分主要是酚酸類物質，主要包含丹參素、丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、原兒茶醛、紫草酸等，其中，丹酚酸A、丹酚酸B是水溶性成分中重要的活性單體[4]。由于丹參對照藥材所含成分較多，各斑點分離不完全；原兒茶醛非丹參專屬性成分，故取消以丹參對照藥材、原兒茶醛為對照的鑒別。此外，樣品中丹酚酸B鑒別色帶較重，斑點分離度較差，故優(yōu)化以丹酚酸B為對照的鑒別，選用熱水超聲提取、乙醚萃取代原標準中采取的甲醇超聲提取、過D101大孔吸附樹脂柱、再用水飽和乙酸乙酯萃取的繁瑣操作，優(yōu)化后的方法操作簡單，色譜斑點清晰且Rf值較好，達到定性鑒別目的。

原標準中柴胡薄層鑒別以柴胡對照藥材為對照，對照藥材色譜中斑點較多，供試品色譜與對照藥材色譜相應位置上僅顯一個相同顏色熒光斑點，故對柴胡薄層鑒別進行優(yōu)化。經查閱文獻，柴胡中柴胡皂苷主要有柴胡皂苷a、柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷d等[5]。采用柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷d對照品為對照進行研究，結果：供試品中，在與柴胡皂苷b2對照品相應的位置上，斑點清晰，Rf值較好。故選擇柴胡皂苷b2對照品作為柴胡的專屬性鑒別項。

3.2 HPLC色譜分析

3.2.1 指標成分選擇 原標準以大黃素為含量測定指標，考慮大黃素為虎杖和決明子共有成分，專屬性不強，該試驗旨在增加本品專屬性強的含量測定方法。連錢草、金錢草為雙君藥，連錢草主要含萜類、黃酮和黃酮苷類、有機酸類等[6]，金錢草的主要化學成分是黃酮和酚酸類化合物[7]，這兩味藥化學成分相似，經對兩味藥中主要成分蘆丁、木犀草素、槲皮素、山柰素進行含量測定探索性研究，所測成分含量均較低，且專屬性差，不宜作為本品含量測定的指標性成分。處方中虎杖為臣藥，其主要成分虎杖苷在處方中專屬性強、含量高，故增加虎杖中虎杖苷作為含量測定指標。

3.2.2 流動相選擇 本試驗條件參考了《中國藥典》2015年版一部[8]“虎杖”項下虎杖苷含量測定，流動相為乙腈-水(23∶77)。結果，虎杖苷色譜峰純度、重現性較差。根據參考文獻，試驗考察比較了乙腈-水(18∶82)[9]、乙腈-0.1%磷酸溶液系統(tǒng)梯度洗脫。結果，乙腈-0.1%磷酸溶液條件下峰純度符合要求，無拖尾現象。故以乙腈為流動相A，0.1%磷酸溶液為流動相B，按照表1規(guī)定進行梯度洗脫。

3.2.3 前處理方法選擇 考察了甲醇、乙醇和稀乙醇對提取效果的影響，結果以稀乙醇為提取溶劑提取的虎杖苷含量最高；超聲處理、加熱回流、振搖提取效果無明顯差異，為了方便操作，故選超聲提取方法；超聲15、30、45 min，虎杖苷含量基本一致。綜合考慮，以稀乙醇超聲處理30min作為虎杖苷的提取條件。

3.2.4 HPLC法耐用性考察 本研究考察了色譜柱[ Ultimate XB-C18( 250 mm×4.6 mm)、Ultimate LP-C18( 250 mm×4.6 mm)、Ultimate AQ-C18( 250 mm×4.6 mm)]，柱溫(30 ℃、35 ℃、40 ℃)，流動相酸度(乙腈-0.05%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸)，流速( 0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min)，考察發(fā)現，不同條件所得檢測結果無明顯差異，RSD值均在3.0%以下，色譜圖所示虎杖苷峰型具備對稱性，且尖銳，呈現出良好的分離度，表明此法在不同色譜柱、不同柱溫、不同磷酸濃度、不同流速耐用性良好。

綜上所述，本研究制定的金錢膽通顆粒質量控制方法準確可靠、專屬性強、重現性好，可以作為控制金錢膽通顆粒質量的有效方法。