桐花樹胎生發育過程中內源性脫落酸、赤霉素和糖分含量的變化

楊盛昌，盧 磊，諸 姮，李文清

(1.廈門大學環境與生態學院、濱海濕地生態系統教育部重點實驗室，福建 廈門 361102；2.福建省濱海濕地保護與生態恢復工程技術研究中心，福建 廈門 361102)

桐花樹(Aegicerascorniculatum)是紫金牛科，桐花樹屬(Aegiceras)的紅樹植物，在我國的廣東、廣西、福建均有大面積的分布。桐花樹生長在海岸潮間帶，水淹、高鹽、缺氧和潮水周期性的沖刷等逆境導致了其形成泌鹽、胎生等特殊的適應方式[1]。

所謂胎生，是指種子成熟后不經過休眠或只有短暫的休眠直接在母體上萌發的現象[1-2]。紅樹植物的胎生可分為兩種方式，即顯胎生和隱胎生。顯胎生的種子在萌發時，胚軸突破果皮之外逐漸延伸長成一個柱狀的幼苗，具顯胎生現象的紅樹植物以紅樹科的紅樹屬(Rhizophora)、秋茄屬(Kandelia)和木欖屬(Bruguiera)等為主；隱胎生的種子萌發時胚軸并不會突破果皮而一直為果皮所包被，以桐花樹屬和海欖雌屬(Avicennia)紅樹植物為代表。有關胎生的形態描述很多，如Juncosa(1982、1984)曾研究了美國紅樹(Rhizophoramangle)和毛瓣木欖(Bruguieraexaristata)的胚胎發生和幼苗形態變化[3-4]。Farrant 等(1993)認為紅樹屬和海欖雌屬紅樹的胎生是跳過成熟干燥期的胚胎發育過程[5]。游學明等(2005)則研究胎生紅樹植物桐花樹大小孢子發生及雌雄配子體發育過程，發現胎生桐花樹的大小孢子發生及雌雄配子體發育過程與典型的非胎生陸生植物相似[6]。在紅樹植物胎生機制的研究方面，Sussex(1975)曾提出美國紅樹種胚在發育后期不會脫水，無法誘導內源性脫落酸(Abscisic Acid，ABA；化學式C15H20O4)的合成從而導致胎生，并且幼胚離體培養試驗也表明幼胚不能吸收外源性ABA[7]。Farnsworth等(1998)則通過比較胎生和非胎生紅樹植物的內源性ABA含量，證實胎生紅樹植物成熟種子缺少休眠階段與其內源性ABA含量低有關[8]。進一步的研究表明，胎生和非胎生紅樹植物的內源性ABA含量受鹽漬環境影響，但在胎生過程中的變化趨勢不會改變[9]。Ismial等(2010)認為在大紅樹(Rhizophoramucronata)的胎生發育過程中，ABA能調控脫水蛋白的特異性表達，其中50 kD的縮水蛋白與胎生的啟動相關[10]。胎生過程體現了紅樹植物從外在形態發育到內在分子調控機制的適應，從分子機理與調控機制角度研究紅樹植物胎生過程揭示胎生現象的本質對理解紅樹植物胎生本質具有重要的意義[11]。

在植物生長發育過程中，內源性赤霉素(Gibberellin，GA；化學式C19H22O6)與ABA存在一定的拮抗作用，例如ABA能誘導種子休眠，抑制早萌發生，但GA卻使種子休眠解除[12]，植物可以通過控制兩種激素的相對平衡調節萌發和休眠[13]。GA是廣泛存在的一種植物激素，化學結構屬于二萜類酸，由四環骨架衍生而得，至少有38種，分別被稱為GA1、GA2、GA3……等，其中GA3含量較高，活性較強[14]。紅樹植物胎生與其內源性ABA含量低有關，那么內源性GA是否參與紅樹的胎生過程？王潔等(2008)曾采用高效液相色譜法測定了顯胎生紅樹植物木欖(Bruguieragymnorhiza)繁殖體的內源性ABA和GA3含量，發現GA3在木欖的種子形成和萌發早期含量較高，而ABA含量較低，認為高水平GA3與木欖紅樹植物顯胎生現象的發生有關[14]。本研究以隱胎生紅樹植物桐花樹為材料，研究了其在不同胎生發育時期繁殖體的內源性ABA和GA3含量變化，同時測定了受兩種生長調節激素直接調控的淀粉和可溶性糖含量的變化，希冀能進一步明確紅樹植物胎生過程中內源性ABA、GA3含量及其比例的變化規律，并從ABA和GA3的協同調控角度，豐富對紅樹植物胎生機制的認識。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集和保存

桐花樹的花蕾、種子(未見胚軸萌動)、萌發早期繁殖體(幼胚軸長約為8 mm)、萌發晚期繁殖體(胚軸長約為4.5 cm，外表黃褐色，已成熟，即將脫離母體)采于福建省云霄縣漳江口紅樹林國家級保護區(23°53′—23°56′N，117°24′—117°30′E)，時間為2011年4—5月。在桐花樹的不同物候期，采取相應材料5份，每份質量約為50 g，用冰盒帶回實驗室，置于-70 ℃冰箱中保存。

1.2 主要實驗儀器

實驗用主要儀器包括Agilent 1200 高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)、SDS紫外檢測器(美國安捷倫科技有限公司)、Hypersil ODS柱[4.6 mm i.d.(250 mm, 5 μm)](美國賽默飛世爾科技公司)、Thermo紫外分光光度計(美國賽默飛世爾科技公司)、SHZ-3循環水真空泵(上海滬西分析儀器廠有限公司)、RE 52-3旋轉蒸發儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)等。

1.3 試劑

ABA、GA3標樣和聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)均購自美國Sigma公司，色譜級甲醇購自國藥集團，濃硫酸(質量分數為98.3%)、蒽酮以及其他試劑均為國藥集團的分析純級產品。

1.4 分析方法

樣品的處理參考文獻[14]并略加改進，增加了乙酸乙酯(體積分數為80%)萃取的次數以提高ABA和GA3的回收量。

色譜條件：Hypersil ODS 色譜柱[4.6 mm i.d.(250 mm，5 μm)]，流動相為35%(體積分數)的甲醇(含 0.15% 0.1 mol/L H3PO4)，其流速為1.0 mL/min, 檢測波長分別為 245 nm和 208 nm，用于ABA和GA3含量的測定，進樣量均為 20 μL，柱溫為30 ℃。

可溶性糖和淀粉含量的測定分別參照李合生(2000)[15]和鄒琦(2000)[16]的方法。

每一指標重復測定5次。采用單因素方差分析法(One-way ANOVA)對實驗數據進行統計分析。

2 結果與討論

2.1 ABA和GA3含量的高效液相色譜法測定

采用外標峰面積法測定ABA和GA3含量。用色譜峰面積分別對ABA和GA3含量作線性回歸曲線，計算得到的ABA和GA3標準工作曲線方程分別為ABA：y=142 762x+3.260 4(R2=0.994 2，p<0.01)；GA3：y=640 35x-60.188(R2=0.992 2,p<0.01)。

2.2 桐花樹胎生過程中內源性GA3和ABA含量的變化

桐花樹胎生過程中不同繁殖體內源性GA3和ABA含量的變化如圖1所示。從花蕾期到種子萌發晚期，內源性GA3含量呈現出先升后降的變化趨勢，即從花蕾期到種子期，GA3含量迅速提高，并在種子期達到最高值，為(12.60±0.05)μg/g；然后隨種子萌發，GA3含量快速下降，并在種子萌發晚期達到最低值，為(1.97±0.05)μg/g。不同發育時期的ABA含量變化趨勢則表現為先降低后升高的趨勢，花蕾期ABA含量最高，為(1.86±0.07)μg/g，種子期迅速下降至最低值，為(0.75±0.07)μg/g，種子萌發之后，ABA含量逐漸上升。

圖1 桐花樹胎生過程中GA3和ABA 含量的變化

桐花樹的繁殖體隨著胚胎發育進程，GA3/ABA含量比值的變化趨勢是先升高后降低(圖2)。種子期GA3/ABA含量比值最高，達到47.01，約為花蕾期的18倍。種子萌發早期GA3/ABA含量的比值明顯下降，但仍高于花蕾期和種子萌發晚期，花蕾期和種子萌發晚期GA3/ABA含量比值較小且差別不大。

圖2 桐花樹胎生過程中GA3/ABA含量比值的變化

2.3 桐花樹胎生過程中可溶性糖和淀粉含量變化

在不同發育時期，桐花樹繁殖體的可溶性糖含量呈先升高后降低的變化趨勢(圖3)。花蕾期可溶性糖含量最低，為(9.39±2.15)mg/g，種子期提高到(18.10±1.14)mg/g，種子萌發早期可溶性糖含量達到最高值，為(31.20±0.97)mg/g，萌發晚期則下降到與種子期相當的水平。隨著胎生發育進程，桐花樹繁殖體的淀粉含量呈現逐漸升高的趨勢，即花蕾期淀粉含量最低，種子萌發晚期淀粉含量最高，萌發晚期淀粉的含量約為花蕾期的3倍，種子期與萌發早期的淀粉含量相差不大。

圖3 桐花樹胎生過程中可溶性糖和淀粉含量的變化

在不同發育時期，桐花樹繁殖體的可溶性糖/淀粉含量比值出現波動，從花蕾期到萌發晚期比值呈現先升高后降低的現象(圖4)。最高值出現在種子萌發早期，達0.90±0.12，種子萌發晚期降至最低值，為0.33±0.04，花蕾期與種子期的可溶性糖/淀粉含量比值相差不大。

圖4 桐花樹胎生過程中可溶性糖/淀粉含量比值的變化

2.4 討論

2.4.1 內源性激素與紅樹植物胎生的關系 有關紅樹植物胎生現象與內源性GA3關系的研究較少[14]。Farnsworth(2000)在其綜述文章中指出紅樹內源性GA3可能參與了胎生過程，但未有相關數據的支持[2]。非胎生植物的種子內源性GA3含量通常很低[17-18]，而本實驗的結果卻顯示桐花樹胎生種子有高含量的內源性GA3，其含量超過了種子形成期和種子萌發后的各個時期。王潔等(2008)對紅樹植物木欖繁殖體的研究也得到相似的結果[14]。繁殖體內源性GA3含量水平的大幅度變化表明內源性GA3對紅樹植物種子的胎生可能起到了顯著的促進作用。

大量研究結果表明，ABA能夠抑制離體種胚體外培養過程中的早萌發生，促進貯藏蛋白質的積累和胚的發育，是導致很多植物種子休眠的原因[16-17]。因此，種子胎生可能是因為種子中缺少ABA或者雖然ABA含量正常但種胚對ABA敏感性較低造成的[2,5-6]。已有研究表明，在高等植物中ABA合成可能是以類胡蘿卜素為前體的間接途徑，所以類胡蘿卜素的生物合成途徑中如有一步反應被抑制或從類胡蘿卜素向ABA轉化受到抑制，都會導致種子中ABA缺乏[2]。本實驗研究表明：桐花樹繁殖體在整個發育時期的內源性ABA含量都很低，并且波動較小，其中種子期的內源性ABA含量最低，花蕾期內源性ABA含量最高。這種現象在木欖[14]、正紅樹(Rhizophoraapiculata)和紅海欖(Rhizophorastylosa)等紅樹植物[8]中都有報道。紅樹植物種子中低水平的內源性ABA難以誘導種子進入休眠狀態，因此導致紅樹植物胎生現象的發生[2,8,14]。

桐花樹種子期的GA3/ABA含量比值最大，為花蕾期和種子萌發晚期的18倍。種子萌發早期的GA3/ABA含量比值雖有明顯下降，約為種子期的1/4，但仍維持比花蕾期和種子萌發晚期高的含量比值，其意義可能在于維持種子的持續萌發和促進生長。此外，與單一GA3或ABA的含量變化相比，GA3/ABA含量比值的變化幅度更為顯著，因此，GA3/ABA的含量比值變化能更為明顯地表征紅樹植物胎生的發生，同時，該含量比值也能反映內源性GA3和ABA對紅樹植物胎生過程的協同調控作用。

2.4.2 糖分含量與紅樹植物胎生的關系 植物中的可溶性糖主要包括果糖、葡萄糖等還原性糖和蔗糖。還原性糖是呼吸作用的直接底物，其含量大小可反映植物用于呼吸消耗的同化產物的水平；蔗糖則是植物體內有機物質運輸和碳水化合物貯藏、積累的主要形式之一[19]。

通常情況下，植物種子休眠時可溶性糖水平較低，代謝水平低下[12]，而本實驗結果發現桐花樹在種子期仍有較高水平的可溶性糖含量，說明桐花樹在種子形成過程中細胞代謝活動旺盛，同時也表明桐花樹植物種子缺少休眠期，換言之，桐花樹植物種子形成后立即萌發，啟動了胎生進程。

種子進入萌發晚期時，桐花樹繁殖體的可溶性糖水平出現大幅度下降，這可能是由于可溶性糖轉變成了貯存物質淀粉的緣故，從而使生長進入相對的停滯期。淀粉含量在桐花樹胎生過程中的上升趨勢也與上述判斷吻合。種子萌發晚期桐花樹繁殖體的淀粉含量達到最高，可以保障成熟胚軸掉落海灘后生長發育所需的物質儲備和能量供給，也是紅樹植物胎生的適應機制之一。

桐花樹可溶性糖/淀粉含量比值在種子萌發早期達到最大值，在種子萌發晚期降至最小。這可能是由于種子萌發早期細胞新陳代謝旺盛，淀粉水解為可溶性糖能供生長發育使用；在種子萌發晚期細胞新陳代謝減弱，大量可溶性糖合成淀粉，生長出現短暫停滯，導致了可溶性糖/淀粉含量比值變小。

2.4.3 胎生過程中內源性激素與糖分含量變化的關系 研究認為內源性GA3可能是啟動α-淀粉酶合成的植物激素，它可以促進α-淀粉酶在糊粉層細胞中的表達[20]。ABA則起著抑制萌發、誘導休眠的作用，它對種子貯藏物代謝相關的淀粉酶等具有抑制作用[18]。Karine等(2002)研究發現大麥糊粉層中，ABA阻礙α-淀粉酶的積累，而GA則促進α-淀粉酶的表達[15]。

通過比較桐花樹繁殖體在不同發育時期的GA3/ABA含量比值和可溶性糖/淀粉含量比值可以發現，花蕾期桐花樹的GA3/ABA含量比值很小，可溶性糖/淀粉含量比值也較低；種子期桐花樹繁殖體的GA3/ABA含量比值達最高水平，但可溶性糖/淀粉含量比值仍然較小，與花蕾期相差不大，這可能與內源性GA3和ABA協同調控可溶性糖和淀粉含量同步增加有關。種子萌發早期桐花樹繁殖體的GA3/ABA含量比值較種子期開始下降，而同期的可溶性糖/淀粉含量比值卻達到最大值，說明萌發早期的種子內部積累了更多的可溶性糖，高于同期淀粉含量的增加，這不僅可能與內源性GA3和ABA共同調控了α-淀粉酶基因的表達有關，也可能與可溶性糖被轉運至萌發種子的量有所增加等有關。可溶性糖為種子早期的萌發生長提供了充足的能量和結構物質。種子萌發晚期時桐花樹繁殖體GA3/ABA含量比值降至較低水平，可溶性糖/淀粉含量比值也相應降至低水平，推測這是由于萌發晚期的繁殖體已經成熟，內源性GA3含量下降，內源性ABA含量提高，可溶性糖向貯藏物質淀粉的轉化增加所致。淀粉含量的增加不僅與胎生種子的形態建成有關，也有利于為胎生種子脫離母體后的生長做準備。

2.4.4 內源性激素協同調控桐花樹胎生的可能機制 在植物生長發育過程中，內源性ABA和GA3會呈現明顯的拮抗作用[12,21]。根據桐花樹胎生發育過程中繁殖體的內源性ABA和GA3含量及其比值以及可溶性糖和淀粉含量及其比值的動態變化，我們推測：①桐花樹胎生的啟動與種子期高水平的GA3和低水平的ABA含量有關；②GA3和ABA通過拮抗作用協同調控了可溶性糖和淀粉含量及其比值的動態變化；③桐花樹胎生進程中伴隨著可溶性糖和淀粉含量的提高，前者促進了種子胎生早期的細胞代謝活性，后者保障了種子胎生進程中的形態建成，為胎生種子脫離母體后的生長提供了物質儲備與能量供給。

紅樹植物的胎生是一種復雜而有趣的生物學現象，與紅樹植物適應生境及進化密切相關[1,22-23]，但有關其分子機制的研究尚不充分，例如：為什么紅樹植物種子期具有高水平的GA3和低水平的ABA含量？內源性ABA和GA3的協調作用的靶位點有哪些？調控方式如何等？這些問題仍有待進一步研究。值得一提的是，生長素、乙烯、細胞分裂素等其他植物生長調節物質也可能參與了紅樹植物胎生發育過程的調控[1-2,8]，其作用機制以及相互之間的協調關系也需要進一步闡明。

3 結論

(1)GA3/ABA含量比值變化能明顯地表征桐花樹植物胎生的發生，同時，該比值也能反映內源性GA3和ABA對桐花樹植物胎生過程的協同調控作用。

(2)桐花樹在種子期有較高水平的可溶性糖含量；進入萌發晚期時，繁殖體的可溶性糖水平出現大幅度下降，而淀粉含量達到最高，可能是由于可溶性糖轉變成了貯存物質淀粉的結果。

(3)α-淀粉酶可以調控可溶性糖和淀粉之間的轉化，可能是桐花樹繁殖體內源性GA3和ABA綜合調控的靶位點。