甘薯、番茄、擬南芥中SPL轉錄因子的生物信息學分析

榮譽磊 周志林 趙冬蘭 唐君 彭湘君 趙玉琪 宗凱 呂亞寧 姚改芳 胡康棣 張華

摘要：對甘薯、番茄、擬南芥中63個SPL基因家族進行了系統進化樹分析、保守蛋白基序（Motif）分析，篩選歸納出同源性較高的2個分支的12個SPL基因進行理化性質分析、核定位預測等，氨基酸序列比對結果表明這些基因的功能可能較為保守。通過對番茄中的SPL基因Solyc05g015510.2、Solyc10g078700.1進行表達量分析，發現這2個基因可能參與調控果實成熟衰老進程。另外，通過對非生物脅迫下的轉錄水平進行分析得知，擬南芥中的AT5G43270可能參與對鹽脅迫、熱脅迫條件下的響應，AT1G27360、AT1G27370可能參與熱脅迫條件下的響應，AT2G42200可能參與冷脅迫條件下的響應，而AT3G57920在非生物脅迫條件下表達量沒有特別明顯的變化，表明AT3G57920可能不參與非生物脅迫下的響應。

關鍵詞：SPL轉錄因子家族;番茄;甘薯;擬南芥;生物信息學

中圖分類號： S188? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）20-0074-10

收稿日期：2021-03-08

基金項目：國家重點研發計劃（編號：2019YFD100070、2019YFD100071、2019YFD1001300、2019YFD1001303）;現代農業產業技術體系項目（編號：CARS-10-B1）;國家自然科學基金（編號：31670278、31970200、31970312、31901993、31872078）;安徽省科技重大項目（編號：16030701073）;中央高校基礎研究基金（編號：JZ2018HGTB0241、JZ 20181）。

作者簡介：榮譽磊（1992—），男，安徽阜陽人，碩士，研究方向為采后生物學。E-mail：990953597@qq.com。

通信作者：胡康棣，博士，副教授，研究方向為采后生物學，E-mail：kangdihu@hfut.edu.cn;張 華，博士，教授，研究方向為植物分子生物學，E-mail：hzhanglab@hfut.edu.cn。

植物基因轉錄水平的調控發生在基因表達的初期，是許多基因表達調控的主要方式。在此調控過程中，被稱為轉錄因子的蛋白質特異結合到靶基因啟動子，控制著一系列相關基因的表達[1-2]。squamosa promoter binding protein box（簡稱SBP-box）基因別稱 squamosa promoter binding protein like（簡稱SPL）基因，可編碼一類綠色植物特有的轉錄因子，調節多個不同并且重要的生物過程，如葉片發育[3]、調節細胞數量和大小[4]、花和果實的發育[5-9]、擬南芥花粉孢子的形成[10]和響應赤霉素（GA）信號[11]等。SPL基因最初是從金魚草（Antirrhinum majus）中分離出來，人們把它命名為SBP1和SBP2，研究發現SPL蛋白通過結合MADS-box基因啟動子的squamosa元件，控制植物花的早期發育。已知的SPL家族成員都具有高度保守的DNA結合結構域（SBP），大約含有76個氨基酸殘基，具有2個典型的C3H（C—C—CH）和C2HC（C—C—H—C）鋅指結構特征，其 C端區域具有核定位信號[12]，能介導SPL蛋白進入細胞核。SPL基因由不同數量的外顯子組成，但所有陸地植物的SBP結構域都是由第一和第二外顯子編碼的，并且這2個外顯子之間的內含子位置也是保守的[13]。SBP鋅指遵循 CC—x—C—x—C—x—[HC]—x—C—x—C—x—H—x—C（x表示氨基酸）的一般模式，其他3種組氨酸都很保守，但不參與鋅的結合[6]。此外，核磁共振技術（NMR）被用來研究擬南芥中SBP轉錄因子SPL4 和SPL7的DNA結合結構域[14]。體外試驗表明，SBP鋅指結構域優先結合序列-TNCGTACAA-[15]，然而，除了它們與DNA結合的能力之外，人們對這些潛在的轉錄調節因子的生理功能知之甚少。

自發現以來，SBP-box基因家族在擬南芥（Arabidopsis thaliana）[16]、水稻（Oryza sativa）[17]、玉米（Zea mays）[18]、小麥（Triticum aestivum）[19]和番茄（Solanum lycopersicum）[20]等植物中均有報道。在擬南芥中，有11個SPL基因受 miR156 調控，已有文獻報道miR156 通過轉錄切割以及翻譯抑制來調節SPL3表達[21]，擬南芥AtSPL1基因能夠參與植物發育和對伏馬菌素B1的敏感性[22]。擬南芥SBP-box基因家族轉錄因子參與花期的轉變，有報道闡明了它們在擬南芥發育中的作用，分析了可能的同源基因SPL9和SPL15的單突變體和雙突變體表型，發現這些基因在控制生殖生長的轉變過程中起著冗余作用。此外，在營養生長過程中，它們的功能缺失導致花序結構改變和分枝增強[23]。對LeSPL-CNR的研究表明，SBP-box基因在調控番茄果實成熟過程中起著重要作用，同時也證明了番茄的大量自然變異受表觀遺傳過程控制的論點[24]。部分SPL可通過調節其他轉錄因子來發揮功能，并且也能參與葡萄糖、無機鹽和腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）生成相關的代謝過程[25]。但是SPL基因家族在甘薯發育中的功能相關研究鮮有文獻報道，在番茄和擬南芥中的基因功能研究也不是很全面，本研究運用生物信息學方法對甘薯、擬南芥、番茄中SPL家族成員理化性質、亞細胞定位、蛋白質基因序列分析、氨基酸序列比對、蛋白結構域及轉錄水平進行分析，并對可能參與的功能進行探討，以期為進一步研究SPL基因在甘薯、番茄、擬南芥中的功能提供借鑒。

1 試驗方法

1.1 SPL基因家族系統進化樹分析與保守蛋白基序（motif）分析

從Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）網站下載擬南芥和番茄中已鑒定的33條SPL蛋白序列作為參考，其中擬南芥中16條，番茄中17條，利用甘薯網站（http：//sweetpotato.plantbiology.msu.edu）中蛋白序列數據庫blastp 檢索甘薯蛋白數據庫獲得30條候選序列。利用MEGA 7.0軟件使用Neighbor-Joining法構建SPL家族蛋白的系統發育樹，利用iTOL工具網站（http：//itol.embl.de/）對系統發育進化樹進行優化。利用MEME網站（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）對SPL蛋白基序（motif）進行分析。將得到的系統發育樹與motif分析結果進行對比，找到同源性較高且系統發育樹結果和motif分析結果吻合的SPL分支進行深入分析。

1.2 SPL基因家族理化性質分析與亞細胞定位預測

利用ExPASy網站（https：//web.expasy.org/protparam/）對2個同源性較高的分支中的12個SPL基因的序列長度、蛋白質等電點、分子量等理化參數進行分析，并利用核定位信號NLS Mapper工具（http：//nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi）預測蛋白質的核定位信號，隨后通過 Cell-PLoc 2.0 預測了這12個蛋白質的亞細胞定位。

1.3 同源SPL蛋白結構域分析及氨基酸序列比對

將上述篩選得到的2個分支12個SPL基因利用SMART（http：//smart.embl.de/）網站分別進行蛋白結構域分析，并利用ESPript 3.0（https：//espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/）網站進行氨基酸序列比對分析。

1.4 番茄中SPL基因表達量分析

將篩選得到的2個分支中番茄的SPL基因利用TomExpress（http：//tomexpress.toulouse.inra.fr/）網站，挖掘基因表達數據，并進行繪圖和分析。

1.5 非生物脅迫條件下的擬南芥中SPL基因表達量分析

將上述篩選得到的2個分支中擬南芥中的SPL基因利用ePlant工具（http：//bar.utoronto.ca/eplant/）獲取擬南芥中非生物脅迫條件下SPL基因的表達數據，并進行繪圖和分析。

2 結果與分析

2.1 甘薯、番茄、擬南芥中SPL家族蛋白進化樹與motif分析

將BLAST同源比對獲得的63條SPL家族蛋白利用MEGA 7.0 軟件構建系統發育樹。如圖1所示，3個分支中，Solyc04g064470.1獨自在一個分支中，表明較其他家族成員親緣性較遠，第2個分支中包括AT5G18830、Solyc01g080670.2、itf01g13650.t1，第3個分支包括其余甘薯、番茄、擬南芥中59個SPL基因。其中甘薯itf05g01080.t1、itf08g18710.t1、itf13g017290.t1與番茄Solyc05g015510.2以及擬南芥AT5G43270、AT1G27370、AT1G27360在同一個分支，說明它們親緣性較高，可能具有相似的基因功能。甘薯itf15g02920.t1、itf01g24210.t1與擬南芥AT2G42200、AT3G57920以及番茄Solyc10g078700.1在同一個分支，說明它們親緣性較高，可能具有相似的基因功能。

隨后，利用MEME網站分析甘薯、番茄、擬南芥中63個SPL家族蛋白的保守蛋白基序（motif）。由圖2可以看到SBP-box 蛋白基序分布，不同顏色的方塊代表不同基序。其中，itf05g01080t1、itf08g18710.t1、itf13g017290.t1與Solyc05g015510.2以及AT5G43270、AT1G27370、AT1G27360的motif具有很大的相似性，這一點與基因家族進化樹的結果相符合，另外，itf15g02920.t1、 itf01g24210.t1與AT2G42200、AT3G57920、Solyc10g078700.1的motif結果也很相似，與進化樹結果一致。

2.2 甘薯、番茄、擬南芥中SPL蛋白家族理化性質與亞細胞定位預測

通過對圖2中保守性較高的2個分支中12個SPL基因核酸序列和氨基酸序列進行理化分析，結果（表1）表明，蛋白質編碼區（CDS）序列長度為 1 038～1 392 bp，蛋白質編碼序列為345～463個氨基酸殘基，蛋白分子量為37 017.17～50 418.90 g/mol，等電點（pI）介于7.94～9.11之間。在蛋白質序列的整個區域內，對SPL蛋白的核定位信號序列（NLS）進行分析，通過 NLS Mapper 網站進行預測。如表1所示，5個擬南芥SPL基因中有3個含有潛在的 NLS，2個番茄SPL基因都沒有含有潛在的NLS，5個甘薯SPL基因中只有1個含有潛在的 NLS，說明部分SPL蛋白可能在細胞核中發揮作用。

同時，利用Cell-PLoc 2.0 預測了這12個SPL家族蛋白的亞細胞定位。如表2所示，12個SPL家族蛋白均定位在細胞核內，值得注意的是其中有3個SPL家族蛋白也存在細胞質內。

2.3 SPL家族蛋白的結構域分析及氨基酸序列比對

對上述12個同源性較高的SPL基因進行結構域分析（圖3），發現這12個基因都具有典型的SBP結構域，且第1個分支的SBP結構域的位置在第170～250個氨基酸，第2個分支的SBP結構域的位置在第50～160個氨基酸，說明這2個分支都具有保守的SBP轉錄因子結構域，但SBP結構域的位置明顯不同。

通過對上述SPL基因進行氨基酸序列對比分析發現，itf05g01080.t1、itf08g18710.t1、itf13g017290.t1、Solyc05g015510.2、AT5G43270、AT1G27370、AT1G27360的序列之間具有差異性，然而均具有高度保守的SBP結構域（圖4-a），保守的SBP結構域包括2個鋅指結構和NLS，第2個鋅指結構與NLS有重疊，itf15g02920.t1、itf01g24210.t1、AT2G42200、AT3G57920、Solyc10g078700.1也具有高度保守的SBP結構域（圖4-b），也具有2個鋅指結構和1個NLS。該結構域富含半胱氨酸和組氨酸的基序，表明在分子層面這些基因也具有高度同源性。

2.4 番茄中SPL基因表達水平分析

分析番茄中2個的SPL基因表達量（圖5）可知，Solyc10g078700.1在番茄組織中大部分時間表達量是處于一個較穩定的狀態，然而在開花后4 d表達量急速增加，在開花后41 d及以后，表達量減少，這說明這個基因可能參與果實成熟過程中相關通路的途徑。Solyc05g015510.2在其他組織中的表達量在0.04左右，但是在果實破色期到紅熟期之間，基因表達量快速上升，這表明該基因可能參與果實成熟衰老的過程。

2.5 擬南芥SPL基因在非生物脅迫條件下的轉錄水平分析

篩選出來的12個SPL基因中，有5個擬南芥基因，在網站里檢索這5個SPL基因在冷、熱、干旱等脅迫下基因的表達量。如圖6-A所示，AT5G43270在遭受鹽脅迫、熱脅迫0.5 h后幼苗中SPL基因表達量急速下降，在這之后的24h內呈上升趨勢，有的甚至超過對照組，說明AT5G43270可能參與擬南芥對鹽脅迫、熱脅迫條件下的反應。圖6-B 中AT1G27360在遭受熱脅迫12 h后幼苗中SPL基因表達量急速上升，超過對照組，說明AT1G27360可能參與熱脅迫條件下的響應。圖6-C中AT1G27370在遭受熱脅迫6 h后幼苗中SPL基因表達量急速上升，在8 h左右時超過對照組，說明AT1G27370可能參與熱脅迫條件下的響應。而根中基因表達量與對照組相比，沒有明顯差異。由圖6-D可知， 另外一個分支中的AT2G42200在冷脅迫條件下 12 h 后幼苗中SPL基因表達量急劇上升，說明AT2G42200可能參與冷脅迫條件下的響應，根中的SPL基因表達量在受到非生物脅迫時幾乎沒有變化。由圖6-E可知，AT3G57920在非生物脅迫條件下表達量沒有特別明顯的變化，說明AT3G57920可能不參與非生物脅迫條件下的響應，根中的基因表達量在受到非生物脅迫時也幾乎沒有變化。

3 討論

本研究利用BLAST同源比對，獲得甘薯、番茄、擬南芥中的63個SPL家族蛋白，并進行進化樹分析，結果表明甘薯itf05g01080.t1、itf08g18710.t1、itf13g017290.t1與番茄Solyc05g015510.2以及擬南芥AT5G43270、AT1G27370、AT1G27360在同一個分支，這7個SPL基因雖然不在同一物種中，但是親緣性較高。甘薯itf15g02920.t1、itf01g24210.t1與擬南芥AT2G42200、AT3G57920以及番茄Solyc10g078700.1在同一個分支，說明它們親緣性較高。motif分析結果與基因家族進化樹的結果相符合，進而歸納出2個SPL基因家族的分支，基因結構域分析發現這2個分支的12個SPL基因都具有典型的SBP結構域。

通過對上述12個SPL基因進行氨基酸序列的對比分析發現，其中含有itf05g01080.t1、itf08g18710.t1、itf13g017290.t1、Solyc05g015510.2、AT5G43270、AT1G27370、AT1G27360的分支序列之間雖然具有差異性，但是均具有高度保守的SBP結構域，保守的SBP結構域包括2個鋅指結構和NLS，第2個鋅指結構與NLS有重疊，itf15g02920.t1、itf01g24210.t1、AT2G42200、AT3G57920、Solyc10g078700.1也具有2個鋅指結構和1個NLS。該結構域的相同結構表明在分子層面這些基因也具有結構同源性。

最后進行基因功能驗證，表明Solyc10g078700.1這個基因可能參與果實成熟過程中相關通路的途徑，Solyc05g015510.2這個基因可能參與果實成熟衰老的過程，擬南芥中AT5G43270可能參與擬南芥對鹽脅迫、熱脅迫條件下的反應，AT1G27360、AT1G27370可能參與熱脅迫條件下的響應。而另外一個分支中可以看到，AT2G42200在冷脅迫條件下12 h后幼苗中SPL基因表達量上升，說明AT2G42200可能參與冷脅迫條件下的響應，AT3G57920在非生物脅迫條件下表達量沒有特別明顯的變化。本研究初步篩選了甘薯、番茄、擬南芥中的SPL基因，并利用生物信息學方法對理化性質、亞細胞定位預測、蛋白基序、氨基酸序列比對、蛋白結構域及轉錄水平進行了分析，并對可能參與的功能進行了探討，為進一步研究SPL基因在番茄、擬南芥、甘薯中的功能提供了一定借鑒作用。

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