蚯蚓糞有機肥對土壤微生物群落的影響

譚駿 黃河 湯薇 朱琳 王冬梅

摘要：將蚯蚓糞有機肥以0.0、4.5、9.0、13.5、18.0 g/kg施加到土壤中進行培養，并種植野菜紅枸杞，待收獲后采集根區土壤，利用高通量測序技術研究添加了不同量蚯蚓糞有機肥的土壤中細菌和真菌多樣性以及群落結構。結果表明，土壤細菌的OTU（運算的分類單位）數目隨著蚯蚓糞有機肥的添加而增加，添加蚯蚓糞有機肥提高了真菌OTU數，但添加量和提高幅度沒有明顯趨勢。同時，蚯蚓糞有機肥提高了土壤中細菌和真菌的多樣性，提高幅度較高的處理分別為E20、E10。此外，從主成分分析可以看出，蚯蚓糞有機肥的施加改變了土壤真菌和細菌的群落結構。從門水平看，細菌主要菌群的豐度沒有發生顯著的變化，而真菌優勢菌群的變化具有明顯的規律;從屬的水平來看，蚯蚓糞有機肥提高了土壤主要細菌菌群中芽孢桿菌（Bacillus）的相對豐度，真菌主要菌群輪枝菌（除了E10處理外）隨著蚯蚓糞有機肥添加的增加呈現先上升后下降的趨勢。綜上所述，添加蚯蚓有機肥能夠增加土壤微生物特有物種數目，并提高益生菌豐度，對農田土壤的安全利用產生了積極影響。

關鍵詞：蚯蚓糞有機肥;土壤;細菌;真菌;高通量測序

中圖分類號： S158;S154.3? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）20-0228-06

收稿日期：2020-11-21

基金項目：廣西南寧市重點研發計劃（編號：20182026）。

作者簡介：譚 駿（1994—），男，湖南冷水江人，碩士研究生，從事土壤修復研究。E-mail：845707092@qq.com。

通信作者：王冬梅，博士，高級農藝師，從事作物遺傳育種研究。E-mail：807487254@qq.com。

有機肥相較于化肥，是一種來源更廣泛、成本更低廉的肥料[1-2]，在改善土壤性質、提高水土保持和保肥緩沖等方面都具有卓越的成效[3]。蚯蚓糞有機肥是使用蚯蚓降解畜禽廢物后得到的產物，除了具有很好的孔性、通氣性、排水性、保水性外，還含有豐富的有機質及N、P、K、Fe、Mn、Zn、Cu、Mg等多種元素[4-5]。在減少化肥農藥施用量、加強禽畜廢棄物資源化利用已成為主流的當下，使用禽畜廢棄區降解后得到的蚯蚓糞有機肥已成為綠色農業發展的趨勢[6]。

蚯蚓糞在養分供應和改善土壤理化性質等方面具有巨大優勢，對于作物生長、產量和品質的提升都能產生巨大的促進作用[7]。張聰俐等研究表明，當蚯蚓糞有機肥的施用量在20%以下時，蚯蚓糞有機肥能有效提高玉米的產量和品質，且添加的量越多，效果越好[8]。呂振宇等通過田間試驗發現，蚯蚓糞有機肥配施無機肥可以顯著增加甘藍產量，并降低甘藍硝酸鹽含量，提高維生素C含量[9]。Federico等通過試驗證明，蚯蚓糞有機肥可增加番茄的株高和果實中碳水化合物含量[10]。李繼蕊等通過盆栽試驗研究發現，黃瓜在使用蚯蚓糞有機肥定植35 d后，株高、莖粗、產量分別增加31.3%、14.0%、36.7%，同時果實品質也有顯著提升[11]。

目前對于蚯蚓糞有機肥的研究多集中于提升作物產量與品質等方面，對于土壤微生物的影響還鮮有報道。在土壤生產力形成的生物進程中，土壤微生物發揮著重要作用[12]，它是土壤生態系統持續發揮功能的重要媒介[13]，是反映與土壤肥力狀況的重要指標[14]。本研究采用盆栽試驗的方法，探究不同添加量蚯蚓糞有機肥對土壤細菌和真菌的影響，以期為未來蚯蚓糞有機肥的推廣提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

盆栽試驗土壤采自南寧市農業科學研究所蔬菜試驗基地。土壤的主要理化性質如下：pH 值為6.2，有機質含量為10.3 g/kg，速效氮含量為 65.5 mg/kg，速效磷含量為15.8 mg/kg，速效鉀含量為70.2 mg/kg。供試作物由南寧市農業科學研究所提供，為野菜紅枸杞。

1.2 試驗設計

試驗于2020年7—8月進行，設置5個處理（表1）。用規格為50 cm×30 cm×25 cm（長×寬×高）的花盆裝土10 kg，種植紅枸杞6株，每個處理重復3次。置于溫室中培養至紅枸杞成熟為止。

1.3 土壤樣品采集

種植1個月后進行破壞性采樣，將紅枸杞連根拔起，直接采集種植點的根區土壤，-80 ℃保存待用，然后送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行后續的DNA提取擴增以及高通量測序過程，測定土壤細菌和真菌的多樣性和群落組成。

1.4 測定方法

1.4.1 土壤DNA提取

土壤總DNA使用試劑盒（FastDNA Spin Kit for Soil）提取。DNA純度和濃度用分光光度計（NanoDrop 2000）檢測。DNA提取質量用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4.2 PCR擴增與純化

細菌。使用引物338F （5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′） 和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對V3～V4 可變區進行PCR 擴增[15]。

真菌。使用引物ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）對ITS（內轉錄間隔區）可變區進行PCR 擴增[16]。

擴增程序。使用的PCR儀為ABI GeneAmp9700 型。3 min 95 ℃預變性;95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，27次循環;最后72 ℃延伸10 min[17]。

擴增體系為20 μL，4 μL? 5×FastPfu緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL引物（5 μmol/L），0.4 μL FastPfu聚合酶，純水補充至20 μL;添加 10 ng DNA模板。使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit[愛思進生物技術（杭州）有限公司]進行純化，Tris-HCl（三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽）洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST[普洛麥格（北京）生物技術有限公司]進行檢測定量。最后利用Illumina （因美納）公司的 Miseq PE300 平臺進行測序。

1.5 數據分析

高通量測序的數據處理及作圖均在上海美吉生物醫藥科技有限公司云平臺上完成。

2 結果與分析

2.1 不同處理對微生物多樣性的影響

由圖1可知，添加蚯蚓有機肥土壤細菌和真菌OTU（運算的分類單位）總數分別為4 012、220個，與CK相比，添加蚯蚓有機肥能增加土壤細菌OTU數，且呈現出添加的蚯蚓有機肥越多，細菌OTU數越多的趨勢，但是對真菌OTU數的影響沒有呈現出明顯的規律。另外，各處理土壤中細菌共同包含的OTU數為1 545個，占總OTU數的38.51%;真菌共同包含的OTU數為97個，占總OTU數的44.09%。CK、E10、E20、E30、E40處理土壤細菌特有OTU分別為101、64、71、69、90個，真菌特有OTU分別為6、3、7、2、10個，這表明添加蚯蚓有機肥使土壤中細菌和真菌特有的OTU數目增多。

從樣本中隨機抽取一定數量的讀數（reads），統計這些序列對應樣本的OTU，以讀數為橫坐標，OTUs為縱坐標，所得曲線即為稀釋曲線[18]，結果見圖2。讀數在10 000以下時，細菌和真菌的OTUs都隨著讀數增加而迅速提高;而在讀數從10 000增加到30 000這個過程中，細菌和真菌的OTUs增長速度放緩;當讀數超過30 000后，細菌和真菌的OTUs趨于平緩。這說明本次測序對土壤中微生物的檢測比率接近飽和，土壤中絕大部分樣本目前的測序量都能夠覆蓋。另外，E40處理土壤真菌OTUs最多，細菌OTUs最多的是E30處理，但與E40處理的差別不大，總的來說添加蚯蚓糞有機肥能提高土壤中微生物OTUs的水平，其中E40處理的最好。

Shannon（香農）指數是評價微生物多樣性的重要指標，其數值越大，則物種多樣性越高，在本研究中細菌和真菌Shannon多樣性指數結果見圖3。對于土壤細菌來說，CK、E10、E20、E30和E40處理的多樣性指數分別為6.59、6.53、6.63、6.59和6.62，各處理之間并無明顯差別;對于真菌來說這5個處理相應的多樣性指數分別為2.00、2.62、1.60、2.13和2.99，其中E10、E30和E40處理土壤真菌多樣性要高于CK，而E20處理的多樣性指數則要明顯低于CK。總的來說，添加蚯蚓糞有機肥提高了土壤中細菌和真菌的多樣性，綜合來看，添加量為18.0 g/kg時的效果最好。

進一步利用主成分分析來探討蚯蚓糞有機肥對土壤細菌和真菌的影響，結果見圖4。對于土壤細菌，PC1軸和PC2軸分別表示不同群落間57.14%和19.58%的變異度，其中，E20和E40處理位于第Ⅰ象限，E30和E10處理位于第Ⅳ象限，CK遠離其他處理獨自處于第Ⅲ象限。對于土壤真菌，PC1軸和PC2軸分別表示不同群落間78.74%和19.26%的變異度，其中E20處理和CK位于第Ⅲ象限，E10和E40處理位于第Ⅳ象限，E30處理獨自位于第Ⅱ象限。綜上所述，添加蚯蚓有機肥對土壤細菌和真菌的群落構成都會產生明顯的影響，且改變蚯蚓有機肥的添加量對土壤真菌群落構成的影響大于細菌，可能是由土壤中真菌群落的穩定性不如細菌所造成的。

2.2 不同處理對土壤微生物群落結構的影響

土壤中細菌和真菌的群落組成如圖5所示，可知在門分類水平上不同添加量蚯蚓有機肥處理下細菌和真菌的群落組成及相對豐度。由圖5-a可知，在門分類水平上，各處理土壤細菌群落和優勢物種的組成基本相同，但是平均相對豐度存在一定差異。在對照CK中，放線菌門為最優勢門，相對豐度所占比例為24.30%。隨著蚯蚓有機肥添加量的增加，酸桿菌門相對豐度呈現先減小后增加的趨勢。綠彎菌門和厚壁菌門也表現出相同趨勢。而門的相對豐度則表現出先增加后減小的趨勢。由圖5-b可知，在門分類水平上，各處理土壤真菌中子囊菌門為最優勢門，相對豐度高達71.94%～91.35%。另外，在門分類水平上，各處理土壤真菌的種類遠遠小于細菌，且相對豐度的變化也沒有呈現明顯的規律。這可能是因為土壤中的真菌數量較少，容易受到環境因素的影響。

在屬的分類水平上，各處理土壤細菌和真菌的群落組成及相對豐度見圖6。土壤細菌芽孢桿菌屬、Vicinamibacterales、鞘氨醇菌屬、JG30-KF-CM45、Geminicoccaceae、Vicinamibacteraceae、Rokubacteriales、Gemmatimonadaceae較為豐富。與對照CK相比，不同添加量的蚯蚓有機肥處理均能提高土壤中芽孢桿菌屬的相對豐度，E30處理效果最好，芽孢桿菌屬的相對豐度提升至8.78%。另外，在屬分類水平上，各處理土壤真菌的群落構成基本相同，輪枝孢菌屬為最優勢屬，相對豐度達19.38%～72.15%，最高值出現在E20處理中。但是，在屬分類水平上，各處理土壤真菌相對豐度的變化沒有規律，這與門分類水平中土壤真菌相對豐度的表現一致。

3 討論與結論

蚯蚓糞有機肥是一種優質生物肥，可以有效修復被污染土壤和改善土壤肥力，并抑制某些植物病害[19]。由于蚯蚓菌肥自身的特點，當其進入土壤后也相應地改變了土壤中微生物的群落結構和活性。土壤微生物在土壤養分的轉化和循環過程中起到了推動作用[20]，是構成土壤肥力關鍵的組成部分，在調節植物生長發育、抑制病害微生物生長的同時，還可以促進植物所需營養元素的循環、土壤肥力的保持及能量的轉化[21]。

在本研究中，當蚯蚓菌肥進入土壤后，土壤OTU數增加，添加蚯蚓菌肥的土壤特有的OTUs數目也要高于空白對照，這一方面是由于蚯蚓菌肥進入土壤后，改變了土壤環境，增加了土壤營養，并影響了土壤中原有微生物的互作，從而使得隨著時間的增加而滅亡部分的微生物數目減少;另一方面可能是由于蚯蚓菌肥自身帶有部分特有的微生物，這部分微生物進入土壤后，成為土壤微生物區系的一部分，從而使得土壤中特有的OTUs數目增加。

而對于土壤細菌和真菌的多樣性指數來說，添加13.5、18.0 g/kg蚯蚓菌肥的土壤的細菌和真菌的多樣性指數要高于CK;添加量為4.5 g/kg的處理降低了細菌的多樣性指數，而增加了真菌的多樣性指數;添加9.0 g/kg的處理增加了細菌的多樣性指數，而降低了真菌的多樣性指數。這說明高添加量的處理能夠提供充足的營養物質，各種類的微生物均能獲得充足的營養元素，從而提高微生物的多樣性，前人研究也證明，添加菌肥能夠提高土壤的有機質和養分水平，從而提高土壤微生物的數量和活性[22]。而低添加量的處理對于土壤中細菌和真菌的影響不一，這有可能是由于在低水平的添加量下，土壤中的營養物質并沒有特別明顯的提高，在這種情況下，對于微生物互作的趨勢并不一致，可能是增加了土壤微生物之間對于能源物質的競爭，使部分劣勢微生物消亡，從而降低了微生物的多樣性，添加有機肥改變了土壤中營養物質的含量和組成比例，從而改變了微生物之間的穩態及其交互作用[23]，并有可能加劇其競爭關系。

由主成分分析可知，添加蚯蚓菌肥顯著地改變了細菌的群落結構，而真菌的群落結構并無明顯的改變，添加蚯蚓菌肥微生物的群落分布特征會隨著土壤環境的改變而改變，而不同的微生物群落有著不一樣的生態功能。其中芽孢桿菌屬細菌具有較強的防病促生和抗逆能力，能夠促進植物生長、增強植物抗逆性[24-25]，在農業生產研究中被廣泛應用，有著較高的經濟價值[26]。在本研究中，添加蚯蚓糞有機肥能有效提高土壤中芽孢桿菌屬細菌的相對豐度，這說明蚯蚓糞有機肥是通過影響土壤中芽孢桿菌屬細菌的途徑來提高作物產量和增強作物抗逆性的。對于真菌來說，子囊菌門真菌具有降解有機物質作用，通常在有機質含量高的土壤中含量豐富[27]。在本研究中，子囊菌門是相對豐度最高的門，而添加了蚯蚓糞有機肥對其的豐度沒用明顯的提高，甚至出現降低的現象，這可能由原土壤中的有機質含量較高所致。

本研究表明添加蚯蚓糞有機肥能夠提高土壤中細菌和真菌的特有物種的數目，并且能夠提高其多樣性指數。總的來說，添加18.0 g/kg蚯蚓糞有機肥的效果最好。此外，添加蚯蚓糞有機肥提高了土壤中芽孢桿菌屬細菌的豐度，這類細菌具有提高作物產量和增強作物抗逆性的作用，可作進一步研究。

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