HPLC-FLD法同時測定直服丹參粉中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2

陽文武 王文婷 張 華 熊有明

重慶市萬州食品藥品檢驗所，重慶 404000

丹參粉是唇形科植物丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)干燥根及根莖制成的粉末，具有活血祛瘀、通經止痛、清心除煩、涼血消癰之功效[1]。丹參喜氣候溫和、空氣濕潤、土壤肥沃的環境，且其藥用部位直接與土壤接觸，易感染真菌[2-4]。黃曲霉毒素是由黃曲霉和寄生曲霉中產毒菌株產生的一類致癌性物質，是目前為止發現的毒性最大的真菌毒素，其毒性相當于砒霜的68倍，對人體及動物器官尤其是肝臟損害嚴重[5]。在植物來源的藥材中主要污染AFB1、AFB2、AFG1、AFG2，其中AFB1 被公認為是主要的有毒物質，從2010年版《中國藥典》開始，就對部分中藥規定：AFB1不得過5 μg/kg，AF(B1+B2+G1+G2) 總量不得過10 μg/kg[1]。目前，關于直服丹參粉中真菌毒素含量測定的研究鮮有報道，而丹參粉配伍三七粉直接泡服已成為預防和治療心腦血管疾病的常用方式，因此對丹參粉中黃曲霉毒素的含量水平進行監測對確保人民用藥安全具有十分重要的意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-20A液相色譜儀(包括 LC-20AT 型四元泵、 SIL-20A 型進樣器、RF- 20A xs型熒光檢測器、CTO-20A 型柱溫箱，日本島津株式會)；SDLA-B-1101型超純水機(重慶圣德利醫療器械研究有限公司)；Waters固相萃取裝置(美國沃特世公司)；AB204S型天平(萬分之一，瑞士METTLER TOLEDO公司)；SIGMA4-16S離心機(德國SIGAM公司)；T25 digital ULTRA-TURRAX分散機(德國IKA公司)。

1.2 材料 乙腈、甲醇，均為色譜純(DIKMA科技公司)；AFB1 、AFB2、AFG1、AFG2混合對照品溶液濃度分別為0.93、0.30、0.93、0.35μg/mL(批號：610001-201703，中國食品藥品檢定研究院)。黃曲霉毒素免疫層析親和柱(Pribolab公司)；水為超純水。50批丹參粉樣品購自重慶市不同區縣的不同藥店(S1丹參粉,重慶康迪藥業有限公司,批號180701;S2丹參粉,成都康美藥業生產有限公司,批號181201331;S3丹參粉,云南向輝藥業有限公司,批號F20190405;S4丹參,成都市祺隆中藥飲片有限公司/包裝打粉;S5丹參,四川圣上大健康藥業有限公司/包裝打粉;S6丹參,四川圣上大健康藥業有限公司/包裝打粉;S7丹參,四川/散裝打粉;S8丹參粉,重慶康迪藥業有限公司,批號181101;S9丹參粉,太極集團四川綿陽制藥有限公司,批號1805002;S10丹參粉,云南向輝藥業有限公司,批號F20190108;S11丹參粉,東方紅西洋參藥業(通化)股份有限公司,批號190301;S12丹參粉,云南七丹藥業股份有限公司,批號1903004;S13丹參粉,太極集團四川綿陽制藥有限公司,批號1707002;S14丹參粉,太極集團四川綿陽制藥有限公司,批號1905001;S15丹參粉,重慶慧遠藥業有限公司,批號181201;S16丹參粉,北京深港藥業有限公司,批號1801006;S17丹參粉,云南向輝藥業有限公司,批號20190108;S18丹參,成都科欣藥業有限公司,批號180401/包裝打粉;S19丹參,四川圣上大健康藥業有限公司,批號180801/包裝打粉;S20丹參粉,四川國強中藥飲片有限公司,批號181001;S21丹參,四川同正堂中藥飲片有限公司,批號181001/包裝打粉;S22丹參粉,安徽省澤華國藥飲片有限公司,批號181001;S23丹參,希美(重慶)制藥有限公司,批號190401/包裝打粉;S24丹參粉,云南向輝藥業有限公司20180522;S25丹參粉,上醫正念堂(成都)醫藥科技有限公司,批號190601;S26丹參粉,北京同仁堂(安國)中藥飲片有限責任公司,批號1904008;S27丹參粉,黃岡金貴中藥產業發展有限公司,批號8050103;S28丹參,安徽協和成藥業飲片有限公司,批號19030406/包裝打粉;S29丹參,成都科欣藥業有限公司,批號180401/包裝打粉;S30丹參粉,洪雅縣瓦屋山藥業有限公司,批號181001;S31丹參,四川中江/散裝打粉;S32丹參,山東,批號180901/包裝打粉;S33丹參,四川中江/散裝打粉;S34丹參,四川中江/散裝打粉;S35丹參,四川中江/散裝打粉;S36丹參粉,成都康美藥業生產有限公司,批號181102011;S37丹參粉,成都康美藥業生產有限公司,批號181201851;S38丹參粉,重慶康迪藥業有限公司,批號180301;S39丹參粉,通化德濟參藥業有限公司,批號20180801;S40丹參粉,成都康美藥業生產有限公司,批號180700061;S41丹參粉,成都康美藥業生產有限公司,批號181201331;S42丹參粉,云南向輝藥業有限公司,批號F20180140;S43丹參粉,重慶康嘉藥業有限公司,批號190201;S44丹參粉,重慶康迪藥業有限公司,批號180901;S45丹參粉,云南七丹藥業股份有限公司,批號1901001;S46丹參粉,云南七丹藥業股份有限公司,批號1906010;S47丹參粉,云南向輝藥業有限公司,批號F20190405;S48丹參粉,太極集團四川綿陽制藥有限公司,批號1812004;S49丹參粉,湖北金貴中藥飲片有限公司,批號A190101;S50丹參粉,重慶康迪藥業有限公司,批號180601)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Inertsustain C18(4.6 mm× 150 mm，5 μm)；柱溫：35 ℃；其余按《中國藥典》2015年版四部通則2351黃曲霉毒素測定法中規定設置[6]。在上述色譜條件下，AFB1 、AFB2、AFG1、AFG2色譜峰分離度>1.5(如圖1所示)。2.2 對照品溶液配制 精密量取黃曲霉毒素混合對照品溶液100 μL于50 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，精密吸取不同體積溶液，注入液相色譜儀，測定峰面積。

2.3 樣品溶液制備 取丹參粉10 g，精密稱定，按《中國藥典》2015年版四部通則2351黃曲霉毒素測定法中供試品溶液制備的方法進行處理[6]。精密吸取各供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系及檢測限 分別精密吸取上述混合對照品溶液5、10、15、20、25 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積為縱坐標，進樣量為橫坐標，繪制標準曲線，結果見表1。由結果可知，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2進樣量分別在9.3～46.5 pg、3.0～15.0 pg、9.3～46.5 pg、3.5～17.5 pg范圍內線性關系良好。在空白基質中依次加入較低濃度的混合對照品溶液后進行測定，以每種化合物的3倍信噪比(S/N=3)確定方法的檢出限。結果見表1。

表1 4種黃曲霉毒素線性關系及檢測限

2.4.2 加樣回收率試驗及精密度 精密稱取已知含量(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2均未檢出)的丹參粉6份，每份約5 g，精密加入混合對照品溶液0.375 mL，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率，AFB1 、AFB2、AFG1、AFG2的平均回收率分別為95.1%、90.2%、95.4%、93.3%，RSD分別為1.7%、2.2%、1.6%、1.3%，表明方法精密度滿足分析要求。結果見表2。

A.對照圖譜；B.樣品圖譜圖1 黃曲霉毒素HPLC圖

表2 加樣回收率試驗結果 (n=6)

續表2

2.5 樣品測定 取50批丹參粉，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，外標法定量。結果表明，50 批樣品中有9批次檢出AFB1，檢出率為18.0%，但都低于藥典部分藥材限量標準，在這9批當中有兩批檢出AFG1，有1批檢出AFG2，所有樣品均未檢出AFB2，結果見表3。

表3 樣品中4種黃曲霉毒素含量測定結果 (n=3)

續表3

3 討論

《中國藥典》2015年版四部通則2351黃曲霉毒素測定法中的色譜條件，只規定了色譜柱的類型，沒有規定色譜柱的品牌、型號，該試驗考察了Diamonsil C18柱、中普紅C18柱、Agilent ZORBAX SB-C18柱和Inertsustain C18柱對黃曲霉毒素分離效果的影響，最終選取Inertsustain C18柱(4.6 mm× 150 mm，5 μm)，在此色譜柱條件下，黃曲霉毒素峰形良好，分離度大于1.5。該試驗采用的方法操作步驟簡便、快速靈敏、重現性好，適用于大批量丹參粉中黃曲霉毒素的快速檢測。

丹參粉不僅可以治療疾病，還有養生保健的功效，很多心腦血管病患者每年都會直接泡服大量丹參粉。雖然該試驗檢測出AFB1的9批樣品均符合藥典限量標準，但AFB1性質穩定，耐高溫，不易分解，容易在人體內積蓄，長期服用含有AFB1的丹參粉，很有可能引起身體不適，甚至會有患癌癥的風險，而《中國藥典》2015年版一部中丹參的檢驗項目未包含黃曲霉毒素，為提高丹參粉的質量，保證人民用藥安全，應加強對丹參粉中黃曲霉毒素的監控。分析結果發現，藥廠生產的丹參粉黃曲霉毒素含量較低，可能與其經過專業設備加工消毒后密封包裝有關[7-8]，但這類產品價格昂貴，大部分居民都是購買丹參后，自己打粉，沒有消毒滅菌，儲存過程中經常暴露在空氣中，在相對濕度較高時，很容易滋生微生物，甚至產生毒素，嚴重威脅老百姓的身體健康。針對這一情況，應做更進一步的研究，以期為人民群眾的用藥安全保駕護航。