西藏樺褐孔菌菌種分離鑒定及多糖高產菌株初篩*

徐愛國 白瑪央宗 旦真次仁 高鵬

（1.西藏自治區高原生物研究所；2.西藏種質資源庫，西藏 拉薩 850001；3.西藏自治區林芝市科學技術局，西藏 林芝 860000；4.西藏百菌農業科技有限公司，西藏 拉薩 850000）

樺褐孔菌,又名斜生纖孔菌，學名為Inonotus obliquus(Fr.)Pilat，屬于真菌門、擔子菌亞門、層菌綱、非褐菌目、褐臥孔菌屬，是一種珍稀的食藥用菌。據文獻資料顯示，樺褐孔菌是前蘇聯各共和國、波蘭、日本等國的民間常用藥物，主要分布于北半球北緯40°～50°的方位內，俄羅斯北部、北歐、中國東北、日本北海道等地。根據文獻資料顯示和科研考察得知，樺褐孔菌在西藏自治區主要分布于林芝地區的米林、波密、察隅及日喀則地區的吉隆溝等地，但是資源量較小，隨著人們的大量采挖販賣，資源量更加稀少，在西藏樺褐孔菌產地原來鄰近村莊的山林已經很難尋覓到樺褐孔菌子實體，若繼續通過采挖野生資源的方式既不能滿足人們需求，也不利于生態保護。因此，我們通過對西藏野生樺褐孔菌資源采集，對其菌種進行分離鑒定，并在相同液體發酵條件下，以其包內多糖和胞外多糖相加的總量為評價指標，初步篩選出西藏樺褐孔菌多糖高產菌株，以備以后進一步研究利用。

1 菌種的分離鑒定

1.1 菌種來源

DZCR161 是西藏自治區林芝市科學技術局旦真次仁于林芝地區采集，為便于描述在本文中編為1號，GP2018 是長期于西藏從事大型真菌在種植工作的高鵬于吉隆分離得到，為便于描述在本文中編為2號，XAG2403 由西藏種質資源庫采集保存，菌種保藏編號為AF0002051XAG2403，為便于描述在本文中編為3號。

1.2 菌種分離純化

選取干凈新鮮的樺褐孔菌子實體，先用氣吹吹去表面的灰塵等雜物，掰開在酒精燈火焰的無菌區域內，用手術刀切取子實體內部約麥粒大小子實體塊，接種到，接入裝有PDA 培養基斜面試管，要將挑取的組織盡量埋入培養基表層，每個子實體分離5 支試管并一一編號，將其置于25℃恒溫培養箱中培養，觀察其萌發情況和生長特性，選取無雜菌污染，菌絲生長粗壯旺盛的試管進行轉接培養，連續幾代后得到純化菌種（見圖1）。

圖1 純化的3株樺褐孔菌菌種

1.3 菌種鑒定

1.3.1 鑒定方法。將純化后的菌種菌絲體為實驗材料，用CTAB 法提取DNA，采用區擴增通用引物ITS4和ITS5 進行PCR 擴增，經凝膠成像系統檢測后將PCR 反應產物送至測序公司進行測序。對測得的ITS區段DNA 序列運用GenBank 中的BLAST 工具軟件在DNA 序列數據庫中搜索同源DNA 序列并進行比較分析，根據BLAST 搜索和比較的結果，結合其形態學特征判斷真菌的物種或與其近緣的物種。

1.3.2 序列BLAST 過程。以序列1 號為例：用bioedit打開1 號的序列，將1 號序列復制粘貼入NCBI 的BLAST 框中進行比對，得到BLAST 的結果，Per Ident高于99%（見圖2），alignments結果顯示序列比對結果與Inonotus obliquus是一致的（見圖3），展開序列，進行下載，查看系統發育樹的結果，可以確認BLAST 結果為Inonotus obliquus（見圖4）。

圖2 BLAST結果

圖3 alignments結果

圖4 系統發育樹結果

2 多糖高產菌株篩選實驗

2.1 液體培養基制作

1L培養基配方：馬鈴薯200g 去皮切成細條、玉米粉10g、豆粕粉10g，加入1000mL 水中煮沸30min，煮熟8 層紗布過濾，取濾液后補足1000mL，加入磷酸二氫鉀3g，硫酸鎂2g，葡萄糖20g，消泡劑5g，攪拌均勻，分裝入500mL 三角瓶內，每瓶裝入培養基月300mL，塞上棉塞，報紙包扎封口后在，高壓滅菌鍋內121℃，滅菌30min 后取出，冷卻至25℃待用。

2.2 液體發酵

將分裝好的液體培養基，在超凈工作臺分別接入1 號、2 號、3 號三個菌種，接種時每個三角瓶接入長滿菌種的斜面培養基約0.5cm2一塊，每個菌種接種5 瓶培養基，接種在磁力攪拌器上25℃攪拌培養，轉速160轉/分鐘，10 天后檢查三角瓶內菌絲球濃密、健壯、均勻、無污染后使用。

2.3 多糖提取

2.3.1 胞外多糖的提取。發酵結束后，取1L 發酵液用中速濾紙，抽慮分離菌絲體和發酵液，將發酵液旋轉蒸發為原體積1/4 左右，然后加入4 倍體積的95%乙醇，充分攪拌使多糖沉淀出來，在4℃下靜置過夜，用95%的乙醇反復沖洗多糖沉淀，以除去摻雜于其中的還原糖和小分子物質，得到下層沉淀在45℃干燥5h后，得到胞外粗多糖，稱重記錄，1 號、2 號、3 號菌種1L 發酵液中提取的胞外多糖分別為14.2g、10.8g、14.0 g。

2.3.2 胞內多糖的提取。取1L 發酵液發酵液，過濾得菌絲體60℃烘干至恒重，將菌體粉碎，加入30 倍體積的去離子水充分破碎，破碎后在80℃下浸提2 h，提取液減壓濃縮至原體積的1/5，加3 倍體積的無水乙醇沉淀，靜置數小時后過濾，沉淀物烘干得到樺褐孔菌胞內多糖，稱重記錄，1 號、2 號、3 號菌種1L 發酵液中菌絲體內提取的胞內多糖分別為8.7g、8.0g、11.5g。

2.3.3 多糖高產菌株篩選實驗結果。實驗數據表明，相同液體發酵條件下，以其包內多糖和胞外多糖相加的總量為評價指標，3 號菌種1L 發酵液所得多糖總量最多為25.5g；其次是1 號菌種22.9g，2 號菌種18.8g，見表1。

表1 多糖產量統計表

3 結論

通過分子鑒定來自與西藏的3 株野生樺褐孔菌1號、2號、3號菌種均為Inonotus obliquus(Fr.)Pilat。

通過對3 株菌菌株液體發酵，以相同條件下每個菌株產胞內、胞外多糖的總量作為評價指標，初步篩選出由西藏種質資源庫采集保存的菌種保藏編號為AF0002051XAG2403 的菌種是西藏野生樺褐孔菌多糖高產菌株。

4 下一步研究思考

通過西藏樺褐孔菌液體發酵代謝產物和分子實體營養成分對比，進一步論證用液體發酵方法替代樺褐孔菌子實體的可能。

用分子育種技術對西藏樺褐孔菌菌株進行選育、液體發酵多糖高產工藝優化以及多糖提取工藝優化來實現樺褐孔菌多糖的高產，進而進行產品開發研究。