基于細(xì)胞水平的甜度定量測定方法及其在卷煙中的應(yīng)用

陳微，凌軍，朱保昆，者為，陳興，蘇莉，顏克亮*

1 云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南省昆明市五華區(qū)紅錦路367號 650231；2 華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，分子生物物理教育部重點實驗室，湖北省武漢市洪山區(qū)珞喻路1037號 430074

甜味化學(xué)感受分子機(jī)制的研究對食品工業(yè)發(fā)展及食用者的健康具有十分重要的影響和意義[1-4]。人的甜味受體是由T1R2和T1R3組成的異源二聚體蛋白復(fù)合體（T1R2/T1R3），每一個受體都包含了一個T1R2亞基及一個T1R3亞基[5]。T1R2和T1R3都是C類G蛋白偶聯(lián)受體，擁有7個跨膜結(jié)構(gòu)域。甜味信號的傳導(dǎo)需要下游的G蛋白、PLCβ2及TRPM5等相關(guān)蛋白的介導(dǎo)，進(jìn)而引起下游PKC、Ca2+、PKA等相關(guān)分子的活化。研究發(fā)現(xiàn)甜味受體T1R2和T1R3可以通過結(jié)合GLP-1來控制體內(nèi)葡萄糖的平衡和葡萄糖轉(zhuǎn)運子的激活。這些相關(guān)分子是可供檢測的下游信號分子[6-11]。

卷煙抽吸時的甜感能明顯提升舒適性，在卷煙產(chǎn)品開發(fā)領(lǐng)域，如何使卷煙具有更好的甜感是一直是相關(guān)研發(fā)人員關(guān)注的研究方向。通常以卷煙感官質(zhì)量評吸為主，一定程度上結(jié)合化學(xué)成分分析進(jìn)行相關(guān)開發(fā)工作。感官質(zhì)量評價主要依靠人的感官評吸，由于香氣物質(zhì)的復(fù)雜性、評吸人員的個體、閱歷等差異，客觀上可能對感官評價結(jié)果帶來差異。

目前檢測甜度的方法主要分為兩大類[12-16]，分析化學(xué)檢測方法和生物學(xué)檢測方法。其中分析化學(xué)檢測方法主要有高效液相色譜法、電子舌檢測方法、甜度計檢測方法、分光光度計檢測方法；生物學(xué)方法有人工測評等。分析化學(xué)方法檢測可以精準(zhǔn)地檢測到糖分含量，但無法在生理水平上定量甜度；生物學(xué)檢測方法雖然可以在生理水平上定量甜度，但是人工測評的主觀性較強、人的口味有差異，無法精確定量甜度。這兩種方法都未能相對直觀、定量地從生理水平對卷煙添加物或卷煙煙氣進(jìn)行甜感評價。因此本文建立一種細(xì)胞水平上的甜度定量測定方法，并用該方法通過測定煙用香精香料及卷煙產(chǎn)品煙氣的相對甜度值對其甜感進(jìn)行評價。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、試劑與材料

滇南特色香料植物5種：密蒙花（BuddlejaofficinalisMaxim.）、三七花（Panax notoginseng(Burk.) F. H. Chen ex C. Chow）、余甘子（PhyllanthusemblicaLinn.）、拐棗（HoveniaacerbaLindl.）、百香果（PassifloraeduliaSims）。

葡萄糖（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，分析純）、三氯蔗糖（廣東翁江化學(xué)試劑有限公司，分析純）、PBS（Medicago, 瑞典）、鈣離子熒光染料（HARVEY，美國）、DMSO（天津市永大化學(xué)試劑有限公司，分析純）、Fluo-4 AM（HARVEY，美國）、人胚腎細(xì)胞系（HEK293）（CCTCC，武漢）、真核細(xì)胞表達(dá)載體（pcDNA3.0）及質(zhì)粒（賽默飛世爾公司，上海）、Flex緩沖液（實驗室自制）、T1R2和T1R3受體均為實驗室自建。

PTI快速離子成像系統(tǒng)（EasyRatioPro）、FV1000共聚焦顯微鏡（Olympus）、DMi8熒光顯微鏡（Leica）。

1.2 方法

1.2.1 熒光標(biāo)記重組甜味素受體質(zhì)粒及細(xì)胞系構(gòu)建

細(xì)胞系構(gòu)建時所用的T1R2（taste receptor，type 1，member 2）的ID號是NM_152232，其基因長度為2520 bp；T1R3（taste receptor，type 1，member 3）的ID號是NM_152228，其基因長度為3475 bp；均來自人類（Homo sapiens）。

選擇真核細(xì)胞表達(dá)載體（pcDNA3.0），T1R2添加his標(biāo)簽（標(biāo)簽序列：CATCATCATCATCATCAT），T1R3添加flag標(biāo)簽（標(biāo)簽序列：GATTACAAGGAT GACGACGATAAG），構(gòu)建甜味素受體T1R2/T1R3的質(zhì)粒。將所構(gòu)建的重組質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)方式轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞HEK293中，篩選出轉(zhuǎn)染帶his標(biāo)簽的T1R2質(zhì)粒和帶flag標(biāo)簽的T1R3質(zhì)粒的細(xì)胞系。

1.2.2 小分子標(biāo)簽的重組甜味素受體細(xì)胞系特征鑒定

用共聚焦顯微鏡觀察T1R2-his/T1R3-flag細(xì)胞系，確定小分子標(biāo)簽的重組甜味素受體蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)定位；以PTI鈣成像技術(shù)檢測小分子標(biāo)簽的重組甜味素受體細(xì)胞系對糖刺激應(yīng)答后受體下游信號分子—鈣離子的響應(yīng)。

1.2.3 方法驗證

以穩(wěn)轉(zhuǎn)T1R2-his/T1R3-flag的單克隆細(xì)胞（穩(wěn)轉(zhuǎn)T1R2/T1R3細(xì)胞）為工具，利用鈣離子熒光檢測技術(shù)，建立可以標(biāo)準(zhǔn)化檢測樣品甜度的體系。以PBS刺激作為對照，以葡萄糖（終濃度為300 mmol/L）和三氯蔗糖（終濃度為10 mmol/L）作為實驗組，將帶已染色的T1R2-his/T1R3-flag細(xì)胞玻片浸潤在PBS中，選擇單個細(xì)胞，從0 s開始，在200000 ms時分別滴加終濃度葡萄糖和三氯蔗糖溶液刺激，檢測胞質(zhì)內(nèi)鈣離子的變化。

1.2.4 相對甜度測定與計算

不同濃度葡萄糖溶液（濃度為50 mmol/L～250 mmol/L）處理穩(wěn)轉(zhuǎn)T1R2/T1R3細(xì)胞能引起胞質(zhì)鈣離子熒光信號的變化，以HEK293細(xì)胞為陰性對照，熒光變化比值為正值，且熒光變化比值與溶液中葡萄糖濃度表現(xiàn)出正相關(guān)。相對甜度值計算公式為：

相對甜度值=（RT1Rs樣品-RCON樣品）/（RT1Rs（葡萄糖）-RCON（葡萄糖））

其中，RT1Rs為處理穩(wěn)轉(zhuǎn)T1R2/T1R3細(xì)胞后的熒光變化值，Rcon為HEK293細(xì)胞（陰性對照）的熒光值，Rsweet（相對甜度值）為二者相差值。

1.2.5 卷煙煙氣相對甜度值測定及對比分析

選用3個云煙（云煙A、B、C）及20個其他規(guī)格卷煙（QT1～QT20）。收集1支卷煙充分燃燒產(chǎn)生的主流煙氣，充分吸收于10 mL Flex緩沖液，作為待測煙氣溶液樣本。分別檢測100 μL煙氣溶液處理HEK293細(xì)胞和穩(wěn)定表達(dá)T1R2/T1R3的HEK293細(xì)胞后胞內(nèi)Fluo-4熒光強度，得出熒光變化比值Rcon，RT1Rs和Rsweet。以150 mmol/L葡萄糖的熒光變化比值Rsweet為標(biāo)準(zhǔn)單位，得到測試樣品相對葡萄糖的甜度值。

將23個卷煙所測定的相對甜度值與卷煙感官評價結(jié)果（《卷煙中式卷煙風(fēng)格感官評價方法》 YC/T 497—2014中“口味評價”方法）進(jìn)行對比分析。

1.2.6 特色香料相對甜度值測定及對比分析

1.2.6.1 特色香料制備

采用不同工藝制備特色香料：密蒙花經(jīng)超聲波輔助乙醇提取，濃縮得到浸膏，再經(jīng)乙醇萃取精制得密蒙花凈油；三七花/余甘子經(jīng)水蒸汽蒸餾，過濾減壓濃縮得三七花/余甘子提取物；拐棗經(jīng)超聲波輔助乙醇提取，過濾濃縮得拐棗浸膏；百香果（鮮）經(jīng)去皮、打漿、過濾濃縮得到百香果濃縮汁。

將特色香料依次用Flex緩沖液稀釋100倍，部分樣品在稀釋100倍過程中出現(xiàn)沉淀，針對此類樣品，先用DMSO作5倍稀釋，再用Flex緩沖液稀釋20倍。檢測100倍稀釋的樣品緩沖液處理后細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光染料Fluo-4 AM的熒光發(fā)射強度，收集并處理熒光強度數(shù)據(jù)，得出熒光變化比值。

1.2.6.2 添加特色香料的卷煙樣本相對甜度值測定及對比分析

將前述5個特色香料樣品中分別添加到云煙（B）煙支中，添加量為1 μL/支，制成待檢煙支。參照1.2.4中方法制備得到煙氣溶液、檢測樣品甜度值。將測得的相對甜度值與卷煙感官評價結(jié)果（《卷煙中式卷煙風(fēng)格感官評價方法》 YC/T 497—2014中“口味評價”方法））進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 小分子標(biāo)簽的重組甜味素受體細(xì)胞系的構(gòu)建

2.1.1 熒光標(biāo)記重組甜味素受體質(zhì)粒構(gòu)建

選擇使用的載體為真核細(xì)胞表達(dá)載體，T1R2添加his標(biāo)簽，T1R3添加flag標(biāo)簽。成功構(gòu)建了甜味素受體T1R2/T1R3的質(zhì)粒。

構(gòu)建的質(zhì)粒圖譜如圖1所示。

圖1 構(gòu)建的質(zhì)粒圖譜Fig. 1 Constructed plasmid profile

2.1.2 受體細(xì)胞系構(gòu)建

將重組質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)方式轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞HEK293中，所轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的細(xì)胞能表達(dá)紅色及綠色熒光蛋白（見圖2），表明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞并穩(wěn)定表達(dá)受體蛋白。

圖2 重組甜味受體表達(dá)情況觀察Fig. 2 Expression of recombinant sweet receptor

2.1.3 小分子標(biāo)簽的重組甜味素受體細(xì)胞系特征鑒定

（1）顯微鑒定。共聚焦顯微鏡觀察T1R2-his/T1R3-flag細(xì)胞系，結(jié)果如圖3所示。可見在N端連接his標(biāo)簽蛋白的T1R2受體蛋白及在N端連接flag標(biāo)簽蛋白的T1R3受體蛋白主要分布在細(xì)胞膜上。當(dāng)表達(dá)量過大時，細(xì)胞質(zhì)中也會有大量融合蛋白出現(xiàn)。同時，顯微鏡下觀察的結(jié)果表明T1R2和T1R3能夠同時在HEK293細(xì)胞中大量表達(dá)。

圖3 小分子標(biāo)簽的重組甜味受體蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)Fig. 3 Expression of small molecule labeled recombinant sweet receptor protein in cells

（2）鈣離子濃度變化。實驗結(jié)果如圖4所示。對照組中，T1R2-his/T1R3-flag細(xì)胞在PBS的刺激下呈現(xiàn)出不規(guī)則變化，在儀器檢測結(jié)果中，胞質(zhì)內(nèi)鈣離子峰值的最高值和最低值在200以內(nèi)。胞質(zhì)內(nèi)鈣離子的變化總體趨于平衡。

圖4 胞質(zhì)內(nèi)鈣離子的變化Fig. 4 Changes of intracellular calcium ions

實驗組一中，T1R2-his/T1R3-flag細(xì)胞在葡萄糖溶液（終濃度為300 mmol/L）加入之后，胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度立刻上升，達(dá)到最高峰值后，胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度下降。在儀器檢測結(jié)果中，胞質(zhì)內(nèi)鈣離子峰值的最高值和最低值相差800左右。

實驗組二中，T1R2-his/T1R3-flag細(xì)胞在三氯蔗糖溶液（終濃度為10 mmol/L）加入之后，胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度在500000 ms時開始上升，達(dá)到最高峰值后，胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度下降。在儀器檢測結(jié)果中，胞質(zhì)內(nèi)鈣離子峰值的最高值和最低值相差700左右。

綜合以上結(jié)果可見：將實驗組與對照組相比，在加入葡萄糖溶液后，T1R2-his/T1R3-flag細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的鈣離子濃度立刻（或延遲）呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢。這個結(jié)果與對照組差異明顯，這表明用一定濃度的葡萄糖刺激T1R2-his/T1R3-flag細(xì)胞，會激活膜上的甜味受體T1R2/ T1R3，并引起下游信號分子—鈣離子的變化。

2.1.4 高表達(dá)甜味素受體細(xì)胞系對糖的應(yīng)答體系的鑒定和優(yōu)化

實驗結(jié)果表明，不同濃度的葡萄糖溶液處理穩(wěn)轉(zhuǎn)T1R2/T1R3細(xì)胞能夠引起胞質(zhì)鈣離子熒光信號的變化（見圖5），HEK293及T1R2/T1R3細(xì)胞熒光信號測定值見圖6-A。以HEK293細(xì)胞為陰性對照，熒光變化比值為正值（見圖6-B），且熒光變化比值與溶液中葡萄糖濃度表現(xiàn)出正相關(guān)性，表明該測定方法中T1R2/T1R3甜味受體能夠特異性響應(yīng)甜味化合物，并能夠通過測定熒光變化比值對甜味化合物進(jìn)行相對定量。

圖5 150 mmol/L 葡萄糖溶液處理HEK293 細(xì)胞和穩(wěn)轉(zhuǎn)T1R2/T1R3 細(xì)胞的熒光變化Fig. 5 Fluorescence changes of HEK293 cells treated with glucose solution (150 mmol/L) and stable T1R2/T1R3

圖6 不同濃度葡萄糖溶液處理HEK293 細(xì)胞和穩(wěn)轉(zhuǎn)T1R2/T1R3 細(xì)胞的熒光變化比值Fig. 6 Fluorescence change ratio of HEK293 cells treated with different concentrations of glucose solution and stable T1R2/T1R3 cells

2.2 利用高表達(dá)甜味受體細(xì)胞系定量檢測卷煙樣本相對甜度值

2.2.1 高表達(dá)甜味受體細(xì)胞系檢測甜味受體對卷煙樣本的應(yīng)答

由檢測結(jié)果可見，23 種卷煙樣品的相對甜度值分布在1.27 ～4.23 之間，不同規(guī)格卷煙相對甜度值有所差異，最高測定值為云煙（A），最低值為QT12。與感官評價結(jié)果（口味風(fēng)格甜味分值）相比具有較好的一致性（見圖7），表明本方法可用于測定卷煙樣本的相對甜度值，并能較好地反映甜度的變化。

圖7 23 種卷煙樣本相對甜度值與口味風(fēng)格（甜味）分值比較Fig. 7 Comparison of relative sweetness value and taste style(sweetness) score of 23 cigarette samples

2.2.2 高表達(dá)甜味受體細(xì)胞系檢測甜味受體對添加特色香料卷煙樣本的應(yīng)答

提取制備得到5 個特色香料，分別添加于云煙（B）煙支中，添加量為1 μL/支，應(yīng)用前述建立的細(xì)胞水平定量測定方法進(jìn)行相對甜度值測定；并組織評吸人員對其進(jìn)行感官評價。結(jié)果如圖8、圖9 和表1 所示。

圖8 特色香料與卷煙煙氣相對甜度值比較Fig. 8 Comparison of relative sweetness value of characteristic flavor and cigarette smoke

圖9 卷煙煙氣相對甜度值與口味風(fēng)格（甜味）分值比較Fig. 9 Comparison of relative sweetness value and taste style(sweetness) score of cigarette smoke

表1 特色香料及應(yīng)用于云煙（B）相對甜度值和感官評價結(jié)果Tab. 1 Relative sweetness of characteristic flavor and Yunyan (B)smoke and sensory evaluation of Yunyan(B) with corresponding characteristic flavor

從細(xì)胞水平定量檢測特色香料相對甜度值結(jié)果來看，以百香果濃縮汁相對甜度最高（S4 = 10.006），其次是拐棗浸膏（S3 = 8.078），以三七花提取物相對甜度最低（S25 = 0.136）；從添加特色香料的卷煙煙氣相對甜度值來看，添加百香果濃縮汁的卷煙煙氣樣品相對甜度最高（S4-煙氣 = 2.18），其次是添加拐棗浸膏（S3 = 2.14）和余甘子提取物（S10 =2.14）的卷煙樣本，與未添加提取物的卷煙煙氣相對甜度值（2.10）相比均有不同程度的提高。

與卷煙感官評吸結(jié)果對比來看：添加百香果濃縮汁（S4）煙氣甜度增加明顯，口腔回甜明顯；添加拐棗浸膏（S3）的卷煙增加了果香香韻，較為協(xié)調(diào)，甜感較好；添加余甘子提取物（S10）的卷煙口腔甜潤，煙氣柔和，但煙氣質(zhì)感略有下降；添加密蒙花（S25）的卷煙余味略甜，口腔和喉部刺激刺激增加。

可見細(xì)胞水平定量檢測特色香料、添加特色香料的卷煙煙氣兩組相對甜度值結(jié)果與卷煙感官評價結(jié)果具有一致性；5 種特色香料中，以百香果整體應(yīng)用效果最好，在增加甜度的基礎(chǔ)上，沒有其他負(fù)面的效應(yīng)。

3 結(jié)論

本文成功構(gòu)建了一種細(xì)胞水平定量檢測相對甜度值的方法，應(yīng)用于特色香料及卷煙煙氣甜度測定，其結(jié)果與卷煙感官評吸結(jié)果具有一致性，表明該方法可用于以增加甜感為目的的卷煙煙用香精香料評價及煙氣甜感評價；同時，本文篩選出一種能獲得較好煙氣甜感與口腔甜感的煙用香料——百香果提取物。