MALDI-TOF MS與16S rDNA方法對乳酸菌鑒定分析比較

宋丹靚敏，陳晴，周夢瑤，張佳欣，程莎莎，方如雪，姜毓君，滿朝新

（東北農業大學食品學院 乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

0 引言

基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜（matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是一種軟電離新型有機質譜技術，是檢測和鑒定多肽、蛋白質的強有力工具[1]，目前已被用于微生物檢測，其具有靈敏度高、準確度高和樣品處理速度快等特點。由于微生物核糖體蛋白和外周蛋白具有特異性，其主要為遺傳因素控制，培養環境、培養基成分等外部因素對其影響較小，通過基質輔助電離微生物蛋白質，可測得蛋白質和多肽的分子質量，形成獨特的蛋白質片段組指紋圖，通過特征性模式峰積累計算，從而實現對微生物的鑒定[2]。

目前，乳酸菌作為國內外常用的益生菌，在我國衛生部2010 年4 月公布的《可用于食品的菌種名單》中，包括6 種雙歧桿菌、14 種乳桿菌、1 種鏈球菌，均屬于乳酸菌[3]。由此可見乳酸菌有著十分重要的經濟價值，但由于其屬種較多，為更好的對其分類，使用快速、可靠的分類鑒定方法顯得尤為重要[4]。但傳統方法費時費力不適于大量乳酸菌的分類鑒定，然而隨著分子技術的發展，一些方法如16S rDNA 序列分析[5]、脈沖場凝膠電泳（PFGE）[6]、限制性片段長度多態性分析（RFLP）[7]、擴增片段長度多態性分析（AFLP）[8]等已用于乳酸菌分類鑒定。而16S rDNA 基因具有高度保守性，因此難以區分具有較高遺傳相似性的菌株，不能系統地研究其遺傳變異及進化歷程相關情況，故該方法更適用于屬內物種之間的區分鑒別[9]。同時，該些方法，需要對于微生物DNA 提取并擴增后進行測序，導致其操作條件要求嚴格、花費時間較長以及費用較高的問題，極大限制了鑒定時效性，無法滿足當今對于乳酸菌快速、廉價及高通量的鑒定要求。本研究以實驗室所保藏以及由發酵乳制品中分離得到的15 株乳酸菌為研究對象，使用MALDI-TOF MS 以及16S rDNA 方法對其進行鑒定，并對該兩種方法的系統歸類學結果分析比較，以此評價MALDI-TOF MS方法用于乳酸菌鑒定及分類的準確程度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

本試驗研究所使用15 株乳酸菌菌株均由東北農業大學乳品重點工程實驗室提供。其中12 株菌株分離自內蒙古傳統發酵乳制品中，3 株參考菌株Lactoba?cillus casei ATCC 393，Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469，Lactobacillus plantarum ATCC 14917，均購于美國菌種保藏中心（ATCC）。

1.1.2 試劑與儀器

MRS培養基，北京索萊寶生物科技有限公司；細菌基因組DNA快速提取試劑盒，BioTeKe公司；三氟乙酸、無水乙醇購于津致遠化學試劑有限公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）、乙腈、甲酸購于融智生物科技（青島）有限公司；MasterMix購于日本TaKaRa公司。

BCN1360 型生物潔凈工作臺，北京東聯哈爾儀器制造有限公司；Eppendorf 5810R 型低溫冷凍離心機，上海艾研生物科技有限公司；DH-101 型恒溫鼓風干燥箱，天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司；HH-s6 型電熱恒溫水浴鍋，青島聚創環保集團有限公司；MAL?DI-TOF MS 基質輔助激光解吸收電離-飛行時間質譜儀，融智生物科技（青島）有限公司；Veriti 96-Well型PCR 擴增儀，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；DYY-8C 電泳儀，北京六一儀器廠；Cheimdox XRS型凝膠成像儀，美國Bio.Rad 公司；BioDrop 型超微量蛋白核酸分析儀，美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株復蘇與培養

將受試菌株按5 %接種量，接種于MRS 液體培養基，37 ℃培養18 h，復蘇后接種于MRS 液體培養基，37 ℃培養24 h 后，于MRS 平板培養基中三區劃線，37 ℃培養48 h，將第二代純化單菌落分別用于MAL?DI-TOF MS鑒定檢測及16S rRNA 測序分析。

1.2.2 MALDI-TOF MS樣品前處理

使用1 μL 接種環挑取純化后劃線所得單個菌落，將微生物菌落涂在靶點中央位置，并攤涂均勻，形成薄層，使用移液器滴加2 μL 甲酸-乙腈溶液，待其自然晾干后，滴加1.5 μL CHCA 溶液，自然干燥備用。

1.2.3 MALDI-TOF MS采集條件

激光能量：5 uJ；激光頻率：5 000 Hz；檢測器電壓：-0.56 kV；聚焦質量（Focus Mass）：10 000 u。

1.2.4 MALDI-TOF MS鑒定及分析

將采集到的數據導入QuanID DB 數據庫與標準菌株的圖譜進行比較，通過對比質荷比和特征峰得到微生物的鑒定結果；根據所收集得到的微生物蛋白質譜圖數據，使用Cluster 3.0 軟件中的聚類分析程序，對該15 株乳酸菌進行聚類分析，分析結果使用Tree?View 3軟件制作樹狀圖及熱圖。

1.2.5 乳酸菌16S rDNA 擴增

在1.5 mL 離心管中加入300 μL 已培養完成的乳酸菌，12 000 r/min離心5 min收集菌體，使用DNA快速抽提試劑盒提取的各菌株DNA，將提取后的菌株DNA 使用超微量蛋白核酸分析儀測定濃度。將所提取的DNA進行PCR擴增，正向引物為27F（5-AGAGT TTGATCCTGGCTCAG-3），反向引物為1492R（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR擴增體系為上游引物1 μL、下游引物1 μL、DNA模板5 μL、ddH2O 27 μL、Taq PCR Master mix 16 μL，總體積50 μL。PCR 擴增步驟：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，72 ℃保持10 min，循環30 次，4 ℃保溫。待擴增反應完畢后，取2 μL 的PCR 產物用質量分數為1.5 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，若PCR 成功則在1 500 bp左右可見清晰的條帶。

1.2.6 16S rDNA 測序及系統發育樹構建

將經過瓊脂糖凝膠電泳檢測后的擴增產物送至北京擎科生物技術有限公司測序，將得到的序列使用DNAMAN 軟件進行拼接及校準，將結果與NCBI 上GenBank 數據庫中的已有序列進行BLAST（Basic Lo?cal Alignment Search Tool，http：//blast.ncbi.nlm.nih.Gov/Blast.cgi）進行同源性比對分析。運用MEGA 5.0軟件，選取鄰接法進行序列分析，構建菌株系統發育進化樹[10]。

2 結果

2.1 乳酸菌DNA 提取及16S rDNA 擴增結果

使用超微量核酸蛋白分析儀對所提取的實驗室所提供的15 株乳酸菌菌株DNA 濃度進行檢測，測定濃度均在1.9 μg/mL 左右，達到要求PCR 擴增濃度要求。經PCR 擴增后，使用1.5 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，15 株乳酸菌菌株擴增結果如圖1 所示，從圖中可看出，在約1 500 bp 處可見清晰明亮的條帶，且無非特異性擴增條帶，表明擴增成功[11]。

圖1 16S rDNA擴增產物電泳結果

2.2 MALDI-TOF MS與16S rDNA 鑒定結果比較

本研究所選用的15 株乳酸菌MALDI-TOF MS與16S DNA 鑒定結果比較列于表1。MALDI-TOF MS 對微生物鑒定為蛋白水平，對微生物的質譜前處理目的為促進微生物細胞破碎，使核糖體蛋白質析出。同時，由于微生物細胞破碎，胞內所含的糖類和脂類物質及其代謝產物亦會溶出，該些物質分子量低于3 000，其譜峰多為雜質峰，難以識別，故選用分子量在3 000～12 000的收集峰進行識別。

由表1 可知，使用MALDI-TOF MS 方法對于本實驗室所保藏的15 株乳酸菌進行鑒定，經QuanID DB 數據庫比對鑒定后，結果均為乳酸菌。其中乳桿菌屬微生物11 株，雙歧桿菌屬微生物4 株，由此可見，MALDI-TOF MS 方法的鑒定水平均可至種水平級別，可有效對未知微生物屬種名稱進行識別。相比較16S rDNA 方法所得的鑒定結果，雖然兩種鑒定方法鑒定的屬級別水平一致，并對標準菌株均有一致的鑒定結果。但兩種鑒定方法對于種水平鑒定結果存在偏差，表現為MALDI-TOF MS 對鑒定結果為類布氏乳桿菌（Lactobacillus parabuchneri），而16S rDNA 鑒定為布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）；MALDI-TOF MS鑒定結果為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei），而16S rDNA 鑒定結果為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）。

表1 15株乳酸菌MALDI-TOF MS與16S rDNA鑒定結果比較

圖2 選取MALDI-TOF MS 與16S rDNA 兩 者結果存在差異的NM-121-1 與鑒定結果一致的標準菌株ATCC393 質譜圖進行比對，發現在m/z 7185.126、7943.827、9600.611 處存在顯著性差異。而基于16S rDNA 方法區分Lactobacillus casei 與Lactobacillus paracasei通常存在誤判，需通過recA基因序列進行輔助分析[12]。

圖2 Lactobacillus casei ATCC 393與NM-121-1質譜圖比較

16S rDNA 作為控制核糖體蛋白生成的一段保守序列，可用作微生物區別手段[13]，是目前可信度較高，應用較廣的傳統微生物鑒定手段。但在本試驗中，種水平不一致鑒定結果的出現，表明使用16S rDNA 方法對于乳酸菌中親緣關系較近的菌株及其亞種的鑒定區分能力存在一定偏差，出現該種結果的原因可能是由于種水平菌株與亞種菌株的核酸序列中堿基差異程度較小，整體序列相似度較高，其差異程度難以區分，導致其分類鑒別能力難度較高。而MAL?DI-TOF MS 方法針對于微生物細胞內整體的核糖體蛋白進行分析比對，再經數據庫進行相關性比較，在數據量及分析能力上更突顯優勢，故可以更好地對于種水平菌株及其亞種進行更為精確的區分。

2.3 MALDI-TOF MS系統發育圖譜

將通過MALDI-TOF MS 鑒定的15 株乳酸菌，使用各自全蛋白譜圖數據，按照其質荷比及相對強度的相似性，進行聚類分析得到樹狀圖及熱圖，如圖3 所示。在圖中，15 株乳酸菌均可歸為同一個大類，這與MALDI-TOF MS 鑒定的所有菌株均屬于乳酸菌的結果一致。同時，圖3 直觀地反映了15 株乳酸菌在蛋白水平的相關性和親緣性，其中4 株雙歧桿菌屬微生物親緣關系較近，歸為一類；布氏乳桿菌與類布氏乳桿菌被歸為一類，但干酪乳桿菌與副干酪乳桿菌被分為同一大類下的兩個小類；加氏乳桿菌及嗜酸乳桿菌與其他菌株分類水平較遠。以上結果的出現，表明MALDI-TOF MS 方法所得到的微生物全譜圖數據，可較好的對乳酸菌進行聚類分析，并可通過聚類熱圖，在一定程度上明確不同種屬水平菌株差異蛋白的所在，為進一步探討菌株間的差異提供基礎。

圖3 15株乳酸菌的MALDI-TOF MS聚類分析圖

2.4 16S rDNA 系統發育樹構建

16S rDNA 鄰近連接方法系統發育歸類如圖4 所示。該圖反映了15 株乳酸菌在16S rDNA 水平下的親緣關系與位置。雙歧桿菌屬4 株菌與乳桿菌屬11株菌被分為兩個大類。其中，布氏乳桿菌與類布氏乳桿菌相對偏差較小，被分為1 個分支；干酪乳桿菌與副干酪乳桿菌雖有一定偏差，亦被分為1 個分支；羅伊氏乳桿菌與其他乳桿菌差異較大，與其他乳桿菌分為2個分支。對比MALDI-TOF MS 聚類分析熱圖與16S rDNA 系統進化樹，兩者均可較好的將雙歧桿菌屬微生物及乳桿菌屬微生物進行分類；但MAL?DI-TOF MS 聚類熱圖中顯示干酪乳桿菌與副干酪乳桿菌的分類距離較遠，表明使用MALDI-TOF MS 所得蛋白譜圖數據進行聚類分析可有效區分，這與MALDI-TOF MS 與16S rDNA 對干酪乳桿菌與副干酪乳桿菌的鑒定結果一致，表明MALDI-TOF MS 可有效區分親緣關系較近的菌株及其亞種，而16S rD?NA 方法對于種水平菌株及其亞種區分有一定缺陷。

圖4 15株乳酸菌16S rDNA序列系統發育樹

總體看來，在兩種分類學方法計算下，15株乳酸菌的系統發育樹及MALDI-TOF MS聚類熱圖存在一定差異，不同種屬水平微生物的分之地位及下級分支有所不同。表明兩種分類學方法對于乳酸菌相關分析有一定差異存在，但均適用于乳酸菌的親緣關系分析。

3 結論

MALDI-TOF MS 作為一種新興的軟電離質譜技術，有著高通量、高靈敏度、低成本等優點，其前處理方法簡便，鑒定結果獲取時效快的特點，使得該技術廣泛應用于微生物鑒定之中。其鑒定水平較高，可至微生物種屬的水平。相比于16S rDNA 方法，MAL?DI-TOF MS 基于微生物外周蛋白和核糖體蛋白的差異對于不同種屬水平微生物進行鑒別，僅需將固體培養基中單菌落涂抹至靶板，經前處理操作后即可得出結果，省略了純化及DNA 提取的步驟，極大縮短了微生物鑒定的時間，以乳酸菌為例，可提前約12～18 h 得出鑒定結果。對于基因型相近的乳酸菌，如干酪乳桿菌與副干酪乳桿菌，相比于16S rDNA 方法，MAL?DI-TOF MS 基于細菌表達的蛋白指紋進行鑒定，可顯示出更精確的區分。雖然MALDI-TOF MS 方法對于微生物鑒定結果準確率較高，但其蛋白質標識峰歸類法與16S rDNA 所用的基因學方法對于乳酸菌歸類仍有差異。整體說來，MALDI-TOF MS 可作為一種快速、簡便、高效率的微生物鑒定技術，應用于多個領域之中。