溫度對籠目海帶配子體生長發育的影響

陳書秀，李 霞，趙 楠，孫 娟，史 良，李曉捷

( 山東東方海洋科技股份有限公司，國家海藻與海參工程技術研究中心，山東省海藻遺傳育種與栽培技術重點實驗室，山東 煙臺 264003 )

籠目海帶(Kjellmaniellacrassifolia)，又稱厚葉切氏海帶、厚葉解曼藻，屬褐藻門、褐藻綱、海帶目、海帶科，主要分布于日本北海道函館和室蘭的深水區[1]。籠目海帶含有較豐富的巖藻多糖硫酸酯，且其他雜糖含量相對較少，因此是制備提取巖藻多糖的良好優質原料。巖藻多糖硫酸酯具有調節血脂、降血糖、降血壓、抗腫瘤等功效[2]。

籠目海帶是一種大型褐藻，一般在冬季和初春生長和繁殖，研究溫度、光照對其生長、發育的影響，對苗種繁育及養殖均有重要意義。已有很多溫度、光照、營養鹽與海帶(Laminariajaponica)生長發育的相關報道[3-9]，但針對籠目海帶的研究還較少。目前，海帶種苗生產主要采用孢子體采苗，兼有配子體克隆育苗[10]，與孢子體采苗相比，配子體克隆育苗可使品種純度高且育苗時間不受季節限制。雖然配子體克隆育苗技術在海帶試驗中應用較廣，但在規模化生產上應用較少[11]，這主要是因為海帶雌、雄配子體的發育不同步以及孢子放散量的限制，從而限制其在實際規模化育苗中的應用。

筆者以籠目海帶雌、雄配子體為材料，通過顯微觀察配子體生長、發育狀況，計算配子體萌發率等，探究不同溫度對其配子體生長、發育的影響，為籠目海帶克隆育苗技術提供參數，為籠目海帶規模化育苗打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及培養條件

籠目海帶配子體保存條件為溫度10 ℃，鹽度31，光照度1000 lx，光周期24L∶0D。在直徑12 cm的培養皿中進行培養，取適量的雌、雄配子體，分別用300目篩絹過濾，獲得2～5個細胞的細胞段懸濁液，按照2∶1的比例，將雌、雄配子體混合，取10 mL懸濁液加入到直徑12 cm的培養皿中，置于不同溫度下培養，光周期10L∶14D，光照度1000 lx。海水經過濾、消毒、冷卻后，添加硝酸鈉、磷酸二氫鉀、檸檬酸鐵作為培養液，培養液中總氮4 mg/L、總磷0.4 mg/L、鐵0.05 mg/L。溫度設置5、8、12、15、20、25 ℃ 6個處理組，每組3個平行。

1.2 配子體生長、發育指標的測定

在顯微鏡下觀察配子體的生長發育狀態，每3 d顯微拍照1次，培養周期為30 d。

配子體發育率的計算：每個培養皿隨機觀察10個100倍視野，分別統計卵囊形成、排卵、幼孢子體和總細胞數，萌發率為卵囊形成數、排卵數和孢子體數之和占總細胞數的百分比。

1.3 數據處理

用SPSS 19.0軟件對發育率進行單因子方差分析、多重比較，P<0.05表示差異顯著。用Excel軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 不同溫度對籠目海帶配子體細胞形態的影響

在20 ℃條件下時，籠目海帶配子體僅營養生長，不發育，無卵囊形成，外觀形態變化見圖1a～c。隨培養時間的延長，配子體細胞段分支，顏色深，細胞質分布均勻，細胞段數目增多，配子體的細胞數量顯著高于其他各組(圖2)；25 ℃條件下，配子體大量死亡，極少數的存活細胞生長極度緩慢且不發育(圖2)。

圖1 籠目海帶雌配子體生長發育過程Fig.1 Growth and development of female gametophytes in seaweed K. crassifoliaa.打碎后的雌配子體； b.雌配子體營養生長初期； c.雌配子體營養生長后期； d.雌配子體卵囊形成； e.雌配子體排卵； f.幼孢子早期形態.a.fragment of female gametophyte; b.early stage of vegetative growth of female gametophyte; c.late vegetative growth stage of female gametophyte; d.oogonium development of female gametophyte; e.ovulation of female gametophyte; f.early morphology of juvenile sporophyte.

在5～15 ℃條件下，15 d后，約有5%～15%的雌配子體發育為成熟的卵囊(圖1d)；15～28 d，大部分雌配子體生成成熟卵囊、排卵并受精形成幼苗(圖1e、f)。其中5 ℃和15 ℃條件下最終的卵囊形成率、排卵率及小苗形成率顯著低于8 ℃和12 ℃處理組(圖2a～m)，28 d時，8 ℃和12 ℃條件下配子體發育率為85%～90%，其中約50%為多細胞幼苗(圖2f、i)。

2.2 不同溫度對籠目海帶配子體萌發率的影響

試驗結果表明(表1)，第15天，8、15 ℃條件下有卵囊形成，12 ℃條件下出現卵囊形成并排卵，5 ℃條件下出現卵囊及排卵的時間稍晚于以上3組。高溫(20、25 ℃)最終均未出現配子體發育。在整個培養周期中，溫度對籠目海帶配子體萌發率有顯著影響(P<0.05)。多重比較結果表明，從第19天開始，溫度為8、12 ℃時萌發率顯著高于其他各組。第28天，5、15 ℃時最終萌發率為23.85%、34.41%，8、12 ℃時最終萌發率高達88.47%、88.59%(圖3)。

表1 籠目海帶雌配子體在不同溫度下萌發情況觀察 %

圖3 不同溫度下籠目海帶配子體萌發率Fig.3 The germination rate of gametophytes in seaweed K. crassifolia exposed to different temperatures小寫字母下標相同數字的為同一組多重比較，同一組的不同字母表示差異顯著(P<0.05).The letters on the histogram with the same number are compared as the same group; the different letters in the same group represent significant differences (P<0.05).

籠目海帶配子體發育的最適溫度為8～12 ℃，低溫5 ℃和高溫15 ℃均對其配子體的發育有抑制作用，高于20 ℃時配子體不能正常發育。

3 討 論

3.1 溫度對籠目海帶配子體生長的影響

方宗熙等[12]發現，人工培養條件下海帶雌、雄配子體均可形成無性繁殖系(又稱克隆系)并可單獨培養，此后其逐步并廣泛應用于基礎生物學研究以及海帶雜交育種[13-14]。曾呈奎等[15]最早發現，海帶配子體適宜生長和適宜發育的溫度條件分別是15 ℃和10 ℃；李曉捷等[16]對901海帶配子體的研究也得出相似結論，并且發現25 ℃是其致死溫度。本試驗結果表明，籠目海帶配子體在20 ℃時生長速度顯著高于其他組，這與孫娟等[17]對多肋藻(Costariacostata)配子體的研究及王軍等[18]對利尻海帶(L.ochotensis)配子體的研究結論相似。

3.2 溫度對籠目海帶配子體發育的影響

本試驗中觀察到，籠目海帶配子體在5～15 ℃均可發育，8～12 ℃下，大部分配子體(80%～90%)進入生殖生長狀態，且50%以上為多細胞幼苗。在5、15 ℃條件下，大部分配子體(70%～80%)處于營養生長狀態，雖有部分配子體(20%～30%)進入生殖生長狀態，但明顯滯后于8～12 ℃溫度組。20 ℃和25 ℃下所有配子體維持在營養生長狀態。王軍等[18]也發現，溫度對利尻海帶的配子體成熟度有影響，在10 ℃條件下，雌、雄配子體的成熟度最高；在20 ℃條件下，配子體不發育。Martins等[19]證實，掌狀海帶(L.digitata)配子體生長的最適溫度為10～18 ℃，而發育的最適溫度為5～15 ℃。Schreiber[20]發現，糖海帶(L.saccharina)配子體生長的最適溫度為13～18 ℃，而發育的最適溫度為6 ℃。

4 結 論

筆者僅利用單因子試驗研究溫度對籠目海帶配子體生長發育的影響，結果表明，海帶配子體發育的最適溫度為8～12 ℃，建議大規模育苗前期采用8～12 ℃，以達到短期內獲得大量孢子體的目的。但是各種環境因子對海帶配子體的生長發育的影響一般存在著交互作用，因此籠目海帶配子體發育所需的最佳環境因子如光照度、光照周期及鹽度等是下一步研究的重點，以便為籠目海帶的大規模養殖提供理論支持。