基于氣相離子遷移譜技術分析杜仲葉茯磚茶加工過程中揮發性成分

曾 橋，呂生華，段 潔，邊文文，劉 靜，孫 敏，張靜嫻，劉 媛，楊文娟，馮小龍，余鄭綠

（1.陜西科技大學輕工科學與工程學院，陜西西安 710021；2.陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西西安 710021；3.陜西省產品質量監督檢驗研究院，陜西西安 710048；4.通化唐亦舒食品有限公司，吉林通化 134000；5.陜西樸道茶業股份有限公司，陜西西安 713700）

茯磚茶為黑茶類后發酵茶[1]，具有金花普茂，菌香濃郁，湯色紅濃，口感醇厚的特征[2]，常以黑毛茶為原料，經篩選、渥堆、氣蒸、壓制成型、發花干燥和陳化等一系列復雜工藝加工而成[3]。近年來，以茯磚茶、普洱茶等為代表的發酵茶類不僅風味和口感良好，而且還具有降脂減肥、降糖、抗腫瘤和抑菌等多種保健功能[4?5]，受到消費者的廣泛青睞。研究表明，茯磚茶的特殊加工工藝有效地降低了茯磚茶的澀味和苦味，促進了醇和口感和紅濃湯色的形成，同時賦予了茯磚茶特有的藥草香、木香、花果香的“菌花香”香氣，極大地提高了產品的風味和品質[6]。

杜仲葉為杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoidesOliver）的干燥葉[7]，長期以來作為中藥材和保健食品的原料，杜仲葉含有豐富的多糖、黃酮、氨基酸、多酚、綠原酸、苯丙素、環烯醚萜類等[8?11]活性成分，具有降壓、降脂、補腎、抗腫瘤和增強免疫等作用[8,12?14]。近年來，結合傳統飲食習慣和地方需求，國家衛計委開展了將杜仲葉按照傳統既是食品又是中藥材的物質管理試點工作，這將極大的促進杜仲葉資源的開發和利用。當前，杜仲葉在食品中的開發主要包括杜仲葉茶、保健飲料[15]和杜仲葉醋[16]等，其中，杜仲葉茶在市場上最為常見。然而現有的杜仲葉茶普遍具有青辛味較重、茶湯發綠或發黑、滋味和口感欠佳等缺點，基于此，本文前期以杜仲葉茶為原料，采用涇陽茯磚茶加工工藝制備了杜仲葉茯磚茶，不僅改善了杜仲葉茶的風味和口感，而且保健功能較傳統茯磚茶更為突出，具有較好的市場前景。

氣相色譜-離子遷移譜法（GC-IMS）是一種新興的氣相分離檢測技術，因具有樣品制備簡單、靈敏度高、分辨率高、操作簡便、分析高效和風味物質可視化等[17]特點而廣泛應用于酒、中藥、海產品、茶葉、乳制品等[18?20]行業。GC-IMS 在茶葉方面主要用于品種鑒別、風味研究、真偽鑒定以及質量評價等，如金文剛等[21]基于GC-IMS 技術對不同綠茶產地制作的“漢中仙毫”綠茶氣味成分進行了特征分析，為“漢中仙毫”綠茶品質控制、產地質量區分與品牌管理提供了依據，李俊杰等[6]采用GC-IMS 結合頂空固相微萃取（Headspace Solid-phase Microextraction, HSSPME） -氣質聯用技術（Gas Chromatography-mass Spectrometry, GC-MS），對手筑茯磚茶發花過程中的揮發性成分變化進行了研究，實現了不同加工階段茯磚茶風味物質的區分。本研究采用GC-IMS 對杜仲葉茯磚茶加工過程中的揮發性成分進行檢測，對杜仲葉茯磚茶加工過程中揮發性成分的變化規律進行分析，這不僅為杜仲葉茯磚茶品質提升提供了證據，而且對于揭示杜仲葉茯磚茶獨特風味和香氣的形成機制以及加工過程中香氣成分的調控提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜仲葉茶 略陽縣嘉靈特種茶開發中心。

FlavourSpec?風味分析儀 德國G.A.S.公司；MS105 電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；CTC-PAL 自動進樣裝置 瑞士CTC Analytics AG公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 杜仲葉茶經篩選、渥堆、氣蒸、壓制成型、發花干燥、陳化等工藝制成，分別于加工過程中的原料篩選、渥堆、氣蒸壓制成型（即發花第0 d），發花第8、25 d 及陳化1 年等6 個階段取樣，依次編號為EF0、EF1....EF5。所取得茶樣迅速破碎混勻，冷凍干燥后，均勻的分為兩份，一份密封儲藏于4 ℃，用于感官內質評審，另一份密封儲存于?80 ℃下待進行GC-IMS 分析。

1.2.2 茶葉感官評審 根據GB/T16291.1-2012《感官分析 選拔、培訓與管理評價員一般導則第1 部分：優選評價員》的相關要求，從陜西科技大學食品科學與工程專業招募感官評審人員，經綜合評價，篩選出20 人進行茶葉感官培訓及考核，最終確定10 人組成茶葉評審小組。按GB/T 23776-2018《茶葉感官審評方法》中關于緊壓茶的規定進行感官評審，同時計算各不同樣本審評得分，其中，各審評因子的評分系數分別為：外形占20%，湯色占10%，香氣占30%，滋味占35%，葉底占5%，茶樣審評總得分計算式如下：

式中：Y 為茶葉審評總得分；A～E 分別為外形、湯色、香氣、滋味和葉底等品質因子的審評得分；a～e 為各品質因子的評分系數。

1.2.3 頂空進樣 精密稱取1 g 樣品，置于20 mL 頂空瓶中，密封后進樣。頂空孵育溫度80 ℃，孵育時間15 min，孵化轉速500 r/min；進樣針溫度85 ℃，進樣體積500 μL，載氣為高純度 N2（純度≥99.999 %），不分流模式。

1.2.4 GC-IMS 條件 MXT-5 色譜柱（15 m×0.53 mm×1 μm），色譜柱溫60 ℃，分析時間30 min，載氣流速初始為2 mL/min，保持2 min；18 min 內線性升至100 mL/min 后保持10 min。

1.3 數據處理

使用儀器配套的分析軟件Vocal 查看分析譜圖和數據的定性，應用軟件內置的NIST 數據庫和IMS 數據庫可對揮發性物質進行定性分析，運用Reporter 插件對比樣品之間的譜圖差異，Gallery Plot插件生成揮發性化合物指紋圖譜，運用Dynamic PCA 插件進行聚類分析，生成揮發性化合物PCA譜圖。

2 結果與分析

2.1 杜仲葉茯磚茶感官評審

對杜仲葉茯磚茶加工過程中所取茶樣的外形、湯色、香氣、滋味以及葉底等5 個相關因子進行感官審評結果如表1 所示。

由表1 可知，篩選的杜仲葉茶原料呈褐色，少梗，沖泡后有較濃青辛氣，湯色黃中帶綠，有一定的苦澀味，葉底黃褐并少梗。渥堆過程既包括微生物生長代謝作用，又包括茶葉自身的酶促作用[22]，對茯磚茶品質形成和后續發花的順利進行有較大影響，杜仲葉茶經過渥堆變得濕潤柔軟，為后續發花提供了適宜的水分，同時經過渥堆，茶葉色澤加深，茶湯的綠色淡化，苦澀味進一步減弱。經氣蒸和壓制后初成型的茯磚茶磚面平整，緊度適中，茶磚表面油亮，茶湯色澤、香氣和滋味變化大不。發花8 d 后，茶磚表面較干燥，稍顯油亮，打開茶磚發現有較茂盛的金花，茶湯呈橙黃色，有明顯的菌花香，苦澀味進一步減弱，有一定的醇和口感，葉底顏色由黃色轉為棕褐。發花25 d 后，茶磚內部金花普遍茂盛，茶湯呈橙紅色，略有青辛氣，具有純正的菌花香和較為圓潤、醇和的口感。陳化過程中，茶磚內部金花顏色由金黃轉為黃褐色，茶湯顏色進一步由橙紅轉為棕紅，菌花香純正，無青辛氣，無苦味，口感更加的圓潤醇和，品質得到了進一步的提升。

表1 杜仲葉茯磚茶感官審評結果Table 1 The result of the organoleptic testing for Eucommia ulmoides leaves Fu brick tea

2.2 杜仲葉茯磚茶加工過程中GC-IMS 二維譜圖分析

圖1 為杜仲葉茯磚茶加工過程中EF0（原料篩選）、EF1（渥堆）、EF2（氣蒸及壓制成型，即發花第0 d）、EF3（發花第8 d），EF4（發花第25 d）及EF5（陳化1 年）樣品的GC-IMS 二維譜圖，圖中縱坐標表示氣相色譜的保留時間（Retention time, Rt），橫坐標表示歸一化處理后的漂移時間（Drift time, Dt），而左側紅色垂直線表示反應離子峰（Reaction ion peak, RIP），RIP 峰兩側的每一個點代表一種揮發性成分，白色表示濃度較低，紅色表示濃度較高，且點的顏色越深表示濃度越大，該譜圖較直觀的反映了茯磚茶加工過程中各不同階段揮發性物質種類及濃度差異[23]。從圖1 中可以看出，杜仲葉茯磚茶加工過程中揮發性成分差異明顯，和原料相比，杜仲葉茶經渥堆處理后揮發性組分更為豐富，且部分組分含量增大，發花8 d和0 d 相比，部分揮發性組分含量變化較大。和其他階段樣品相比，杜仲葉茯磚茶經過陳化后在譜圖上的紅點明顯增多，說明其揮發性成分越來越豐富[6]。

以EF0 為參照，其他階段樣品所含揮發性成分扣減參照后的對比差異情況如圖2 所示，紅色代表該物質在該樣品中濃度高于EF0，藍色則代表低于EF0，而濃度相同的物質顏色抵消后呈白色。總體來看，EF1 和EF2 中紅色部分明顯大于藍色部分，EF3 中紅色部分和藍色部分相當，EF4 中藍色部分略大于紅色部分，而EF5 中紅色部分明顯大于藍色部分。圖1 和圖2 可共同說明杜仲葉茯磚茶加工過程中揮發性成分有明顯的變化。

圖1 不同加工階段杜仲葉茯磚茶的GC-IMS 二維譜圖分析Fig.1 GC-IMS two-dimensional map of samples from different stage during processing of Eucommia ulmoides leaves Fu Brick Tea

圖2 不同加工階段杜仲葉茯磚茶的氣相色譜離子遷移譜差異圖Fig.2 GC-IMS different two-dimensional map of samples from different stage during processing of Eucommia ulmoides leaves Fu Brick Tea

2.3 杜仲葉茯磚茶加工過程中GC-IMS 揮發性成分定性分析

圖3 中所示的每一個數字代表定性分析出一種揮發性氣味物質，整個杜仲葉茯磚茶加工過程中，共檢測出70 種揮發性物質，應用軟件內置的NIST 數據庫和IMS 數據庫可對物質進行定性分析發現，可以明確定性的揮發性物質有51 種，包括部分揮發性物質的單體及二聚體，具體見表2。

表2 揮發性組分定性分析Table 2 Qualitative analysis of volatile compounds

續表2

圖3 杜仲葉茯磚茶的揮發性成分氣相離子遷移譜定性分析Fig.3 GC-IMS qualitative analysis of volatile compounds of Eucommia ulmoides leaves Fu Brick Tea

由表1 可知，明確定性的51 種揮發性物質C 鏈介于C2～C10，主要包括醛類、酮類、醇類、酯類、吡嗪類、酸類、萜烯類、呋喃類、醚類及含硫化合物等，其中醛類、醇類、酮類、酯類、吡嗪類數量較多。和傳統以黑毛茶為原料加工的茯磚茶相比，二者存在一些共有的揮發性成分，包括壬醛、5-甲基糠醛、辛醛、正己醛、芳樟醇、1-辛烯-3-醇、丙酮、乙酸乙酯等[6]，這些揮發性成分都具有特殊的香味，如壬醛在低濃度時具有橙子及玫瑰香氣，5-甲基糠醛具有甜香、辛香氣[6]，辛醛具有醛、蠟香、青果皮香，脂肪和水果香氣，正己醛呈青草氣味[24]，芳樟醇具有柑橘、鈴蘭香、花香、青香及木香，1-辛烯-3-醇呈真菌清香、泥土芳香、蔬菜香，乙酸乙酯則具有似醚的氣味和微果酒香[6]。同時，杜仲葉茯磚茶和傳統以黑毛茶為原料加工的茯磚茶相比[6]，大多數揮發性成分種類不同，說明杜仲葉茯磚茶有其獨特的氣味特征。

醛類是杜仲葉茯磚茶中鑒定出的數量最多的揮發性成分，共計16 種，從表1 可以看出，醛類物質中的2-已烯醛的單體和二聚體、正己醛的單體和二聚體、壬醛單體和二聚體、葵醛、辛醛和異戊醛等主要賦予了杜仲葉茯磚茶青草香，柑橘香、橙子香等果香及花香[6,24?27]，此外，2-甲基丁醛給予了其焦香和烘焙香[28]，3-甲硫基丙醛賦予了其醇厚的醬香、肉香等，由于醛類的香氣閾值較低，因而是影響杜仲葉茯磚茶風味的重要因素。和傳統以黑毛茶為原料加工的茯磚茶相比，杜仲葉茯磚茶中具有青草香氣和果香花香的醛類物質較多[6]，這可能賦予其更好的風味。杜仲葉茯磚茶中鑒定出的醇類揮發性成分有10 種，主要以蘑菇香、花香、清香、草藥香和木香為主，此外，還給予了芝麻、洋蔥、大蒜、肉、咖啡香的香氣特征以及奶酪香等。杜仲葉茯磚茶中鑒定出的酮類和酯類揮發性成分分別有9 種和5 種，其中酮類以果香、甜香和奶香等為主，而酯類主要是果香和微果酒香，鑒定出的吡嗪類揮發性成分有4 種，主要具有青草味，堅果味以及焦香、烤香，上述揮發性成分構成了杜仲葉茯磚茶特有的氣味。

2.4 杜仲葉茯磚茶加工過程中GC-IMS 揮發性氣味成分指紋圖譜分析

為了進一步更具體直觀的表現杜仲葉茯磚茶加工過程中揮發性物質的變化規律，使用Gallery Plot 插件繪制了EF0、EF1、EF2、EF3、EF4 和EF5 的揮發性物質離子遷移指紋譜圖，如圖4 所示，每個樣本3 個平行，圖中右側為樣本名稱，底部為揮發性物質定性結果，各點顏色深淺代表物質濃度高低，紅色代表濃度較高，白色代表濃度較低。

圖4 杜仲葉茯磚茶的揮發性成分指紋圖譜分析Fig.4 Volatile components fingerprint of samples from different stage during processing of Eucommia ulmoides leaves Fu Brick Tea

從圖4 可以直觀看出茯磚茶不同階段揮發性物質組成具有明顯差異，且隨著加工過程的進行，杜仲葉茯磚茶中一部分揮發性成分不斷減少，另有一部分揮發性成分先增加后減少，還有一部分揮發性成分不斷增加。將不同加工階段的杜仲葉茯磚茶樣本指紋圖譜分為A、B、C、D、E、F、G 等7 個區域，A 區域的揮發性成分包括康硫醇、2-甲基-3-甲硫基呋喃、環己酮和2-己酮，上述成分主要具有泥土氣息，熟菜香和洋蔥、大蒜、肉、咖啡香等，在樣本中的相對含量總體上隨加工過程的進行而逐步減少，其中2-己酮自渥堆階段起開始逐漸下降，2-甲基-3-甲硫基呋喃、環己酮和康硫醛在發花過程中下降明顯。B 區域的揮發性成分是壬醛二聚體、二乙二醇丁醚、2-甲基-3-庚酮、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪單體、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪二聚體、2-乙基-5-甲基吡嗪單體、2-乙基-5-甲基吡嗪二聚體、甲基庚烯酮、芳樟醇和γ-松油烯，上述揮發性成分以焦香、烤香、青草香、橘香和果香為主，且在原料中相對含量較低，而經過渥堆處理后上升明顯，這可能是由于渥堆提供的高溫高濕環境促進了糖類物質發生脫水、縮合、聚合等焦糖化反應，從而產生焦香[22]，而甜香、果香和花香則可能是由于渥堆過程中微生物的作用。此外，呈青草香、焦香和烤香的吡嗪類物質在進入發花階段后下降明顯，這有助于改善茶葉的風味。C 區域的揮發性成分為辛醛、乙酸、苯甲醛二聚體、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-戊醇和丙酸，從圖4 中可以看出，這些成分在原料、渥堆和氣蒸及壓制成型階段變化較小，而進入發花階段后，上述揮發性成分明顯下降直至發花結束（25 d），該區域的揮發性成分主要以苦杏仁味、烘烤味和醋味為主，其相對含量的下降有助于產品風味的改善。同時，在陳化階段具有真菌香氣的3-甲基-1-戊醇相對含量明顯上升，從而增強產品菌香味。D 區域包含的鑒定出的揮發性成分包括2,4-庚二烯醛、1-辛烯-3-醇、葉醇、異丙醇、2-庚酮、異戊醛和乙酸異戊酯，這些成分主要以青香、藥香和果香為主，在原料、渥堆和氣蒸壓制成型樣本中含量均較低，但發花促進了上述揮發性成分含量的增加，隨著發花時間的延長，2-庚酮、異戊醛和乙酸異戊酯相對含量繼續增加，至陳化階段則開始下降，而其他揮發性成分則在發花8 d后和后續干燥陳化階段，相對含量開始下降。區域E 中包含的揮發性成分主要有2-庚酮、異戊醛、乙酸異戊酯、3-甲硫基丙醛、2-甲基丁醛和3-呋喃甲醇等，上述揮發性成分以藥香、果香和醇厚的醬香為主，在發花的8～25 d 中增加較為明顯，這對于形成杜仲葉茯磚茶良好的風味具有重要作用。F 區域中包含的揮發性成分包括3-呋喃甲醇、5-甲基糠醛、二氫-2（3H）-呋喃酮單體、二氫-2（3H）-呋喃酮二聚體、丙烯酸正丁酯單體、丙烯酸正丁酯二聚體、2-已烯醛單體、2-已烯醛二聚體、糠醛單體、糠醛二聚體、2,3-丁二醇等，上述揮發性成分主要具有甜香、辛香、青草香和乳酪香，其中，除具有青草味的2-已烯醛單體相對含量明顯下降外，其余成分在杜仲葉茯磚茶陳化階段的含量均高于其他階段。區域G 中包括的揮發性成分主要為二甲基二硫單體、二甲基二硫二聚體、正己醛單體、正己醛二聚體、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇和己酸甲酯，上述揮發性成分以果酒香、果香和青草香為主，值得注意的是，此區域中大多數揮發性成分在加工不同階段相對含量較穩定，包括具有青草香的正己醛單體和二聚體，由于杜仲葉茯磚茶樣本中呈青草香氣揮發性成分較多，除正己醛和其他階段相比變化不大外，其他如2-乙基-5-甲基吡嗪單體、2-已烯醛單體隨加工過程的進行均明顯下降，因此最終杜仲葉茯磚茶中青辛氣不明顯，這和感官評審結果基本一致。此外，不在上述區域中的呈甜香、花香、橙香和橘香的葵醛、壬醛單聚體在隨著加工的進行相對含量逐步上升，促進了杜仲葉茯磚茶良好風味的形成。

從圖4 還可以發現，陳化和渥堆階段紅點最多，說明揮發性成分最為豐富，其次為原料和氣蒸及壓制成型階段，最后為發花階段樣本，這可能是由于在發花階段以冠突散囊菌為主的曲霉屬為絕對優勢菌群，茯磚茶發酵過程中微生物多樣性較低[29?30]導致的，尚需進一步證實。此外，和其他加工階段相比，發花階段促進了杜仲葉茯磚茶藥香、果香和菌香的形成，因此，發花和陳化是促進杜仲葉茯磚茶香氣和風味形成的重要步驟。總體來看，所有的70 種揮發性成分在EF5 中的含量較EF0 上升的有37 種，主要為醛類，醇類，酮類和酯類，這些成分具有良好的香氣，而下降的成分有33 種，其中下降較為明顯的有呈醋酸味的乙酸以及具有青草味，堅果味的2-乙基-5-甲基吡嗪二聚體等，上述成分的含量變化有助于改善杜仲葉茯磚茶成品的香氣。不同香氣成分之間具有一定的協同作用，如甲苯、乙醇、苯甲醛、2-庚酮、乙酸乙酯、乙酸等風味物質可發生加成或協同作用，從使酒香、果香和花香更強烈[31]，酯類香氣物質之間也有較強的協同作用[32]。本實驗表明，和EF0 相比，EF5 中苯甲醛二聚體、2-庚酮、乙酸乙酯含量均增加，而且所鑒定出的5 種酯類揮發性成分中有4 種含量增加，這有助于增強各成分之間的協同作用，從而提升杜仲葉茯磚茶的香氣品質。此外，渥堆樣本中2-乙基-3,5-二甲基吡嗪二聚體，發花8 d 樣本中的2,4-庚二烯醛和發花25 d 樣本中的3-甲硫基丙醛，以及陳化階段5-甲基糠醛、丙烯酸正丁酯單體、丙烯酸正丁酯二聚體、糠醛二聚體、2,3-丁二醇等在圖4 中各點的顏色明顯較其他階段深，說明其相對含量明顯高于上述各成分在其他階段樣本中的含量，這些成分可以分別作為杜仲葉茯磚茶渥堆、發花和陳化階段的候選標記物進行深入研究。

2.5 基于GC-IMS 的主成分分析

主成分分析可以簡化數據并揭示變量間的相互關系，其作為一種多元統計分析技術已廣泛應用于食品加工過程中品質差異分析。從圖5 可以看出，不同加工階段杜仲葉茯磚茶揮發性成分PCA 圖中PC1 的貢獻率為47%，PC2 的貢獻率為27%，累計貢獻率為74%，表明PC1、PC2 的總貢獻率包含了杜仲葉茯磚茶樣本的大部分信息，較好的反映了不同茶樣之間揮發性成分差異的影響因素。從主成分分析圖中可以看出，EF1 和EF2 樣本間距離最近，說明渥堆和氣蒸壓制成型樣本之間差異性相對較小，而EF0 和EF1 樣本間距離較大，說明渥堆對杜仲葉茯磚茶揮發性成分變化影響較大。發花和陳化階段樣本在PCA 圖上和其他樣本呈現明顯的分離，說明茶樣揮發性成分在此過程中發生了很大的變化，發花和陳化對于杜仲葉茯磚茶香氣和風味的形成具有重要作用，這與感官審評結果基本一致。

圖5 不同加工階段杜仲葉茯磚茶揮發性成分主成分分析圖Fig.5 Principal component analysis plot of samples from different stage during processing of Eucommia ulmoides leaves Fu Brick Tea

3 結論

采用 GC-IMS 技術分析了杜仲葉茯磚茶加工過程中揮發性成分，共檢測出70 種揮發性成分，其中明確定性的有51 種，包括醛類、酮類、醇類、酯類、吡嗪類、酸類、萜烯類、呋喃類、醚類及含硫化合物等。通過構建杜仲葉茯磚茶GC-IMS 揮發性成分指紋圖譜和PCA 分析，可明確各不同階段杜仲葉茯磚茶特征風味物質，發花和陳化對于形成杜仲葉茯磚茶香氣和風味特征具有重要作用，最終形成了杜仲葉茯磚茶較好的藥香、果香和菌香。考慮到各不同揮發性成分在賦予茯磚茶良好風味和香氣時的互補和協調作用，因此，除GC-IMS 外，還可以采用GC-MS、電子鼻、氣相色譜-嗅覺-質譜測定法（GC－O－MS）等多種儀器分析和感官評審結合起來進行研究將有助于更準確的評價其風味和品質[33?35]。2-乙基-3,5-二甲基吡嗪二聚體、2,4-庚二烯醛、3-甲硫基丙醛、5-甲基糠醛、丙烯酸正丁酯單體、丙烯酸正丁酯二聚體、糠醛二聚體、2,3-丁二醇等揮發性成分分別在杜仲葉茯磚茶加工特定階段的相對含量遠高于其他階段，可以作為杜仲葉茯磚茶渥堆、發花和陳化階段的候選標記物，后續應進一步對此進行深入研究，從而為杜仲葉茯磚茶的加工水平的提升、風味鑒別和品質評價等提供依據和參考。