不同保鮮處理對鮮濕米線品質(zhì)及腐敗樣品微生物多樣性的影響

徐霞紅，楊 莎，單長松，陳志剛

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京 210095）

米線是亞洲地區(qū)的傳統(tǒng)食品，以秈米為主要原料經(jīng)擠壓成型或切粉制得[1]。鮮濕米線由于食用便捷、口感爽滑而受消費者青睞。但鮮濕米線產(chǎn)品水分含量高，且制作過程極易被微生物污染，加之不適宜采用高壓和長時間滅菌使其保質(zhì)期較短[2]。因此如何有效控制微生物的安全風(fēng)險、保證鮮濕米線的風(fēng)味口感已經(jīng)成為鮮濕米線行業(yè)亟待解決的問題。

鮮濕米線常見的保鮮手段有酸洗、添加防腐劑、熱殺菌、微波殺菌等[3]。酸浸工藝是廣泛使用的一種抑菌手段之一，有機酸浸泡通過改變鮮濕米線體系的pH，破壞了微生物生長的適宜環(huán)境，從而達(dá)到延長保質(zhì)期的目的[4]。酸浸作為一種常見的保鮮技術(shù)在鮮濕米線中已經(jīng)廣泛應(yīng)用，但是單一的酸浸并不能達(dá)到長期保鮮的效果，故需要結(jié)合其他保鮮技術(shù)聯(lián)合使用。目前常用的化學(xué)防腐劑存在一定安全隱患[5]，而生物防腐劑具有更高的安全性而廣受青睞[6]，其中ε-聚賴氨酸鹽酸鹽在人體內(nèi)可分解為賴氨酸，然而其在鮮濕食品中的應(yīng)用較少，需要做進一步研究。鮮濕米線熱殺菌技術(shù)研究較多，但對最佳殺菌工藝無統(tǒng)一定論，一般認(rèn)為水浴時間20～40 min，溫度90～100 ℃為宜，且殺菌技術(shù)常聯(lián)合其他保鮮技術(shù)一起使用具有更好的效果[7]。微波殺菌技術(shù)對米線保鮮有一定效果，但成本大不適應(yīng)于工業(yè)化生產(chǎn)。

目前對鮮濕米線微生物菌群分析主要采用一代測序手段[8]，鮮見基于高通量測序分析菌群結(jié)構(gòu)的報道。傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法步驟繁瑣[9]，只有很少部分微生物可被培養(yǎng)，不能真正反映菌群多樣性。高通量測序技術(shù)能同時檢測出樣本中的所有微生物[10]，為大量不可培養(yǎng)微生物的研究提供契機。

本文在酸浸的基礎(chǔ)上探究生物保鮮劑與水浴殺菌對鮮濕米線貯藏過程中的蒸煮品質(zhì)、感官品質(zhì)、pH 及微生物數(shù)量的變化。對腐敗樣品基于Illumina Miseq 測序平臺進行細(xì)菌16S rRNA V3-V4 區(qū)域及真菌rRNA ITS2 區(qū)域擴增子測序分析，更全面表現(xiàn)不同保鮮方式對菌群多樣性和豐富度的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

秈米 航埠糧油有限公司；檸檬酸 吉林中糧生化能源銷售有限公司；ε-聚賴氨酸鹽酸鹽 浙江銀象生物工程有限公司；CM101 平板計數(shù)瓊脂、CM164 孟加拉紅（虎紅）培養(yǎng)基 北京路橋技術(shù)股份有限公司；HB0176-3 結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 海博生物技術(shù)有限公司；E.Z.N.A.? soil DNA kit Omega Bio-Tek 公司。

MX-5 小型全自動米線機 曲阜智造輸送機有限公司；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海中安醫(yī)療器械廠；P290 平面袋智能真空包裝機 東莞市益廣包裝機有限公司；SW-CJ-1D 單人超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；DHP120 生化培養(yǎng)箱南京生興生物有限公司；J-2 菌落計數(shù)器 江蘇天翎儀器有限公司；AB150pH 計 賽默飛世爾科技公司；ABI GeneAmp? 9700PCR 儀 美國ABI 公司；Illumina Miseq PE300 測序平臺 美國Illumina 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鮮濕米線制作工藝流程及樣品制備

樣品制備：

a. 對照組（CK）：用蒸餾水浸泡2 min，瀝干水分后包裝。

b. 酸浸處理組（CA）：根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果選擇濃度為1%檸檬酸浸泡2 min，此條件下對鮮濕米線感官影響不明顯，產(chǎn)品無明顯酸味。

c. 酸浸結(jié)合ε-聚賴氨酸鹽酸鹽處理組（PL）：ε-聚賴氨酸鹽酸鹽添加量根據(jù)食品添加劑國標(biāo)GB2760-2014 中大米及其制品規(guī)定的限量（上限0.25 g/kg）為基礎(chǔ)確定添加0.2 g/kg。制備時將其溶于蒸餾水中，混入原料秈米中攪拌均勻。

d. 酸浸結(jié)合水浴殺菌處理組（SY）：當(dāng)水浴殺菌時間大于20 min 米線表面變軟，出現(xiàn)黏條現(xiàn)象，故確定水浴時間為20 min，水浴結(jié)束后迅速在冰水浴中冷卻5 min。

所有樣品用高溫蒸煮袋包裝，100 g/包，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中貯藏，無需避光處理。

1.2.2 蒸煮品質(zhì)

1.2.2.1 蒸煮損失的測定 參照文獻并有所改動[11]，稱取5 g 左右鮮濕米線（M1），預(yù)測得水分含量為W，在50 mL 沸水中保持微沸蒸煮5 min，撈出米線后繼續(xù)加熱蒸干大部分水分，取余下米湯于已知質(zhì)量為M2的鋁盒中。在105 ℃下，烘至恒重，記為M3。

1.2.2.2 斷條率的測定 參照郭靜璇等[12]的方法，取20 cm 左右長度均勻的米線30 根，加入500 mL沸騰的蒸餾水保持微沸，煮5 min 后挑出記錄斷條數(shù)n（n 為總條數(shù)-煮后完整條數(shù)）。

1.2.3 感官評分 參考周顯青等[13]的方法并有所改動，綜合米線煮前氣味、外觀和煮后質(zhì)地、滋味等指標(biāo)綜合評判鮮濕米線的感官，以10 分為滿分，低于5 分為不合格，由經(jīng)過統(tǒng)一培訓(xùn)的感官評定小組進行打分，感官評價標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 鮮濕米線感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standard of wet rice noodles

1.2.4 pH 測定 參照Aregbe 等[14]的方法，稱取樣品10 g，與90 mL 去離子水研磨成勻漿，使用pH 計測定樣品在儲藏過程中的變化。

1.2.5 微生物指標(biāo)測定 菌落總數(shù)測定方法：GB4789.2-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》;霉菌、酵母測定測定方法：GB 4789.15-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》；大腸菌群測定方法：GB 4789.3-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗大腸菌群計數(shù)》。

1.2.6 擴增子測序分析 當(dāng)不同配方腐敗后的鮮濕米線可培養(yǎng)微生物達(dá)到5 lg CFU/g 左右，將樣品經(jīng)液氮冷凍磨碎后，采用基因組DNA 提取試劑盒對鮮濕米線微生物進行基因組DNA 提取，并進行PCR 擴增，細(xì)菌采用16S rRNA 基因V3-V4 區(qū)合成引物，338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）進行PCR 擴增。真菌采用ITS rRNA 基因ITS2 區(qū)合成引物，ITS3F（GCATCGATGAAGAACGCAGC）和ITS4R（TCCTCCGCTTATTGATATGC）進行PCR擴增，利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物。PCR 產(chǎn)物目的條帶大小正確，濃度合適后使用NEXTFLEX? Rapid DNA-Seq Kit 進行建庫，利用Illumina 公司的Miseq PE300 平臺測序。使用fastp（https://github.com/OpenGene/fastp，version 0.20.0）軟件對原始測序序列進行質(zhì)控，使用FLASH（http://www.cbcb.umd.edu/software/flash，version 1.2.7）軟件進行拼接，操作分類單元（OTUs）用UPARSE（ Version7.1， http://drive5.com/uparse） 聚類， 用UCHIME 識別和去除嵌合序列。利用RDP classifier（http://rdp.cme.msu.edu/）對每條序列進行物種分類注釋，分別比對Silva（細(xì)菌）和Unite（真菌）數(shù)據(jù)庫，設(shè)置比對閾值為70%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用IBM SPSS Statistics 22 軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析，計算平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差，并進行單因素方差分析，以鄧肯（Duncan）多重比較法進行顯著性分析（P<0.05）。用Origin 2018 軟件作圖。所有生物信息學(xué)分析均基于Majorbio I-Sanger Cloud（www.majorbio.com）在線平臺進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏期間蒸煮品質(zhì)的變化

由于目前對于鮮濕米線的蒸煮品質(zhì)沒有統(tǒng)一的國標(biāo)，故參照湖南省地方標(biāo)準(zhǔn)（DB43/156-2007），認(rèn)為當(dāng)蒸煮損失≥2.0%，斷條率≥15%時，為鮮濕米線蒸煮品質(zhì)的保質(zhì)期終點。由圖1 可知，對照（CK）樣品的蒸煮損失和斷條率均在第3 d 超過可接收值，分別為2.11%±0.11%和21.67%±0.71%。這可能是由于某些微生物的代謝產(chǎn)物能分解淀粉，使擠壓米線的淀粉凝膠結(jié)構(gòu)受到破壞，導(dǎo)致蒸煮損失增加，斷條率變高，米線失去彈性和筋道感。而經(jīng)過不同保鮮處理的米線品質(zhì)劣變都得到延緩。其中酸浸結(jié)合水浴殺菌（SY）的米線，蒸煮損失和斷條率分別在第17 d 和第15 d 達(dá)到2.08%±0.13%和18.33%±0.71%，超過可接收值。儲藏期間蒸煮損失和斷條率不斷緩慢上升，可能是米線中的淀粉體系長期老化所致[15]，而當(dāng)貯藏第13 d 微生物開始迅速生長后米線蒸煮品質(zhì)有較大的下降。

圖1 鮮濕米線貯藏過程中蒸煮損失（A）及斷條率（B）變化趨勢Fig.1 Cooking loss（A）and broken rate（B）trend of wet rice noodles during storage

2.2 貯藏期間感官品質(zhì)的變化

剛制備的鮮濕米線（圖2A-1 和圖2A-2）外觀呈米白色且色澤均一，具有米香味，入口爽滑，韌性好，四組樣品具有相似的感官。圖2 B1～B4 為腐敗變質(zhì)后的米線，當(dāng)貯藏第3 d 可以明顯觀察到CK 組出現(xiàn)發(fā)黏現(xiàn)象，并伴有明顯刺激性氣味，感官評分低于可接受分值（5 分）。這種刺激性氣味可能是由于部分微生物發(fā)酵淀粉產(chǎn)生酒味[16?17]。產(chǎn)品變黏可能與第3 d 突然增多的大腸菌群有關(guān)（見表2）[18]。CA 組、PL 組和SY 組分別在第4、6 d 和17 d 表面出現(xiàn)少量霉斑，且伴隨有霉味，低于感官可接受分值。值得注意的是，保鮮處理后的樣品并未出現(xiàn)發(fā)黏現(xiàn)象。

表2 鮮濕米線貯藏期間微生物生長變化趨勢Table 2 Change trend of microbial population of wet rice noodles during storage

圖2 新鮮制備的米線（A）、腐敗米線（B）的外觀比較和貯藏過程中米線的感官評分變化（C）Fig.2 Comparison of appearance of freshly prepared rice noodles（A）and spoiled rice noodles（B）and sensory changes（C）of wet rice noodles during storage

2.3 貯藏期間pH 的變化

鮮濕米線在貯藏期間的pH 變化如圖3 所示，對照組樣品的初始pH 為5.62±0.06，經(jīng)過酸浸處理初始pH 為4.51±0.08，低于對照組。CK 組、CA 組及PL 組樣品的pH 隨著微生物的生長而降低，相比之下，CK 組的下降幅度較處理組更明顯，當(dāng)貯藏3 d 后下降了0.47。pH 降低的主要原因可能是微生物利用樣品中的營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)酸[19]，而保鮮處理后的樣品微生物生長受到抑制，使其發(fā)酵產(chǎn)酸減少，pH 變化較小。SY 組在較長時間內(nèi)保持穩(wěn)定的pH，當(dāng)貯藏11 d 時pH 有略微的上升，在此時該樣品組微生物開始生長，當(dāng)貯藏13 d 之后微生物大量生長時pH 由于微生物代謝產(chǎn)酸而再次下降，在貯藏17 d 后，從第13 d 的4.61±0.01 下降到4.22±0.09。

圖3 鮮濕米線在貯藏過程中的pH 變化Fig.3 Changes in pH of wet rice noodles during storage

2.4 貯藏期間微生物生長的變化

參考廣西（DBS 45/050-2018）、云南（DBS 53/017-2014）等地方標(biāo)準(zhǔn)[20]，認(rèn)為當(dāng)菌落總數(shù)超過5 lg CFU/g 或霉菌總數(shù)超過2.2 lg CFU/g 或大腸菌群超過1.4 lg CFU/g 時為微生物指標(biāo)的最大限值。由表2 可知當(dāng)貯藏2 d 時CK 組樣品霉菌和細(xì)菌總數(shù)都已經(jīng)超過或接近標(biāo)準(zhǔn)。CA 組、PL 組均能短時間抑制微生物的生長，分別在第3 d 和第5 d 達(dá)到微生物上限。SY 組使鮮濕米線的微生物在15 d 內(nèi)不超標(biāo)，但在貯藏11 d 后逐漸檢測出酵母及細(xì)菌生長，在第17 d 霉菌（3.58±0.06 lg CFU/g）和大腸菌群（3.52±0.04 lg CFU/g）都超過最大限值。

2.5 腐敗米線樣品中細(xì)菌和真菌多樣性分析

為保證菌落豐度達(dá)到測序要求，將可培養(yǎng)微生物達(dá)到5 lg CFU/g 左右且感官不可接受的樣品進行高通量測序，分別對CK 組、CA 組、PL 組和SY 組貯藏第3 d、第4 d、第6 d 和第17 d 的樣品進行測序。

2.5.1 鮮濕米線中微生物Alpha 多樣性分析 由表3得所有樣本的Coverage 指數(shù)均大于0.99，說明測序結(jié)果覆蓋較多且可信。SY 組ACE 指數(shù)和Chao1指數(shù)較其他組小，細(xì)菌ACE 指數(shù)為31.40、Chao1 指數(shù)為30.25，真菌ACE 指數(shù)為13.00，Chao1 指數(shù)為10.50，說明SY 組的物種豐富度較低[21]。這是由于水浴處理后耐熱性差的微生物被殺死或生長受到抑制，使物種豐富度明顯減少。CK 組樣品細(xì)菌Shannon指數(shù)較大，Simpson 指數(shù)較小，分別為2.18 和0.17，真菌Shannon 指數(shù)較小，Simpson 指數(shù)較大，分別為0.27 和0.88。表明在未做任何抑菌處理時細(xì)菌菌落豐度及多樣性水平相對較高，而真菌多樣性水平較低[22]，說明細(xì)菌在淀粉基質(zhì)上的生長力強于真菌[18]。

表3 鮮濕米線腐敗樣品α 多樣性Table 3 The Alpha diversity indices of spoiled wet rice noodles

2.5.2 不同分類水平上細(xì)菌及真菌物種組成分析

2.5.2.1 基于門水平的腐敗樣品菌群結(jié)構(gòu)分析 由細(xì)菌在門水平上的樣本群落組成結(jié)構(gòu)（圖4A）可知，變形菌門（Proteobacteria）為所有樣品的主要優(yōu)勢菌，其中厚壁菌門（Firmicutes）在CK 組和SY 組都具有較高的相對豐度，當(dāng)酸浸處理后厚壁菌門減少到0.81%，PL 組其相對豐度減少到0.51%。但SY 組長期貯藏后厚壁菌門占比提高到40.84%，這可能是因為厚壁菌門在極端環(huán)境下能生成芽孢或分生孢子，等環(huán)境適宜后再生長，所以在CK 組和SY 組樣中都有較大占比[23]。

圖4 細(xì)菌（A）和真菌（B）相對豐度分布（門水平）Fig.4 Abundance distribution of bacteria（A）and fungi（B）（phylum level）

由真菌的群落組成結(jié)構(gòu)圖（圖4B）可知，毛霉門（Mucoromycota）是對照樣品的優(yōu)勢菌門，占比93.83%，經(jīng)過酸浸處理后毛霉門減少，說明酸浸可以明顯抑制毛霉門的生長，PL 組和SY 組該菌門所占比例減少至0.1%以下。對于保鮮處理組，子囊菌門（Ascomycota）成為優(yōu)勢菌門，在CA 組、PL 組和SY 組分別占比53.04%、99.98%和99.73%。這可能是由于子囊菌門在酸處理、熱處理等逆境中能形成孢子，當(dāng)環(huán)境適宜再大量繁殖，所以在抑菌處理后其占比明顯上升，成為優(yōu)勢菌門[24]。

2.5.2.2 基于屬水平的腐敗樣品菌群結(jié)構(gòu)分析 由細(xì)菌屬水平上的群落組成結(jié)構(gòu)圖（圖5A）可知對照樣品中細(xì)菌群落分布較為均勻，泛菌（Pantoea）所占比例最大為30.79%，其次為鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas），占比為26.30%，芽孢桿菌（Bacillus）的占比為21.96%。這一結(jié)果與黃永平等[25]、陳志渝[8]通過傳統(tǒng)培養(yǎng)法研究鮮濕米線優(yōu)勢腐敗菌為腸桿菌科和芽孢桿菌的結(jié)果一致。泛菌和芽孢桿菌是常見的水稻內(nèi)生菌，主要來源于原料秈米中[26?27]。鞘氨醇單胞菌廣泛分布于水體、土壤、空氣中，是一種耐受貧養(yǎng)微生物[28?29]。酸浸處理組樣品中，適宜在中性環(huán)境生長的鞘氨醇單胞菌的相對豐度下降至0.01%以下[30]，使腸桿菌科的未分類腸桿菌（unclassified_f_Enterobacteriaceae，24.49%）、泛菌（21.77%）相對豐度上升，成為主要優(yōu)勢菌。ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對芽孢桿菌、腸桿菌都有抑制作用，所以PL 組其相對豐度都明顯下降。SY 組的主要優(yōu)勢菌為腸桿菌科和芽孢桿菌。這可能是由于腸桿菌科雖然耐熱性較低，但水浴殺菌只能損壞其細(xì)胞表面，使其生長受到抑制，卻不能完全將其殺滅[31]。而芽孢桿菌耐受能力強[23]，在逆境中可形成芽孢防止危害，后期適應(yīng)環(huán)境后迅速繁殖[32]。

圖5 細(xì)菌（A）和真菌（B）相對豐度分布（屬水平）Fig.5 Abundance distribution of bacteria（A）and fungi（B）（genus level）

根霉菌屬（Rhizopus）、枝孢菌屬（Cladosporium）、鏈孢霉屬（Neurospora）、青霉屬（Penicillium）等都是在米制品中的常見真菌屬[33]。由真菌屬水平群落組成結(jié)構(gòu)圖（圖5B）可知根霉菌屬（Rhizopus，93.83%）是對照樣品的優(yōu)勢菌屬，根霉菌具有較強致腐能力，可產(chǎn)生水解酶分解淀粉產(chǎn)生乙醇，縮短樣品保質(zhì)期[34]。當(dāng)保鮮處理后根霉菌屬相對豐度顯著降低，樣品保質(zhì)期延長。酸浸樣品中能適應(yīng)廣泛pH 范圍（pH3～9）的鏈孢霉（Neurospora，34.91%）相對豐度明顯提升。PL 組根霉屬和鏈孢霉屬相對豐度降低為0.01%以下，青霉（Penicillium，47.8%）成為主要優(yōu)勢菌屬。由于各菌屬耐熱能力不同，水浴處理后菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化[35]，耐熱性較強的枝孢霉菌（Cladosporium）成為優(yōu)勢菌[24]。

2.5.3 主成分分析（PCA） 基于歐氏距離（非加權(quán)）算法在OTU 水平進行主成分分析。細(xì)菌（圖6A）和真菌（圖6B）前兩個主成分的貢獻率分別為88.46%和89.52%，說明這兩個主成分可以反映出不同處理樣品微生物差異的大部分信息。通過PCA 分析發(fā)現(xiàn)，四組不同處理的樣品微生物組成差異明顯，由圖6A 可知在PC1 上PL 組和其他樣品相距較遠(yuǎn)，說明在這一主成分水平該樣品與其他樣品細(xì)菌群落特征差異較大。由圖6B 可知在PC1 上CK 組的真菌群落結(jié)構(gòu)組成與其他樣品距離較遠(yuǎn)，說明經(jīng)過不同保鮮處理在PC1 上對真菌群落特征有較大影響。在PC2 上SY 組與其他樣品相距較遠(yuǎn)，說明在這一主成分水平熱處理對真菌群落有較大影響。

圖6 細(xì)菌（A）和真菌（B）主成分分析Fig.6 Principal component analysis of bacteria（A）and fungi（B）

3 結(jié)論

本文研究了鮮濕米線在25 ℃貯藏條件下品質(zhì)變化和微生物生長的情況及其關(guān)聯(lián)性。實驗結(jié)果表明，SY 組在較長貯藏時間內(nèi)品質(zhì)指標(biāo)及pH 下降都較緩慢，提高了產(chǎn)品的貯藏穩(wěn)定性并延長貨架期至13 d。CA 組、PL 組保質(zhì)期分別延長為2 d 和4 d，且相比對照組樣品具有較低的蒸煮損失和斷條率，pH 降低較對照樣品少。經(jīng)過保鮮處理后的樣品腐敗后不再出現(xiàn)發(fā)粘現(xiàn)象，而是表面產(chǎn)生霉斑。

通過對腐敗樣品的微生物多樣性分析可得：所有樣品的優(yōu)勢細(xì)菌門為變形菌門，其次為厚壁菌門。CK 組厚壁菌門相對豐度較高，CA 組及PL 組明顯減少了厚壁菌門的相對豐度。CK 組的優(yōu)勢腐敗細(xì)菌為泛菌、鞘氨醇單胞菌和芽孢桿菌。CA 組明顯降低了鞘氨醇單胞和芽孢桿菌屬的相對豐度。ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對各優(yōu)勢菌屬都具有較強的抑制作用，伯克氏菌（Burkholderiales）成為PL 組的優(yōu)勢菌屬。對照組的優(yōu)勢腐敗霉菌門為毛霉門，優(yōu)勢腐敗菌屬為根霉菌屬，在保鮮處理后其相對豐度明顯降低（<0.1%）。而抗逆境能力較強的子囊菌門成為保鮮處理后樣品的主要優(yōu)勢腐敗真菌。

綜上所述，本文所運用的保鮮技術(shù)（尤其是酸浸結(jié)合水浴處理）可以有效抑制微生物生長，降低產(chǎn)酸和致腐能力較強微生物的相對豐度，從而延緩食用品質(zhì)和pH 下降，達(dá)到延長貨架期的目的。本研究結(jié)果為鮮濕米線保鮮及其工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論基礎(chǔ)。