響應面法優化金槍魚蒸煮液發酵制備海鮮調味基料工藝

王新宇，谷 秀，位正鵬，王 鵬，李銀平，閆鳴艷，劉瑞志,*

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266003；2.中國環境科學研究院，北京 100012；3.海洋功能食品國家地方聯合工程實驗室，山東榮成 264309；4.青島科技大學海洋科學與生物工程學院，山東青島 266042）

我國是水產品捕撈和加工大國，每年都有數以萬噸的水產品出口海外，2019 年我國水產品出口額占農產品出口總額比重達30%，其中金槍魚出口又占據了重要的地位，因為魚肉罐頭受到各國人民的喜愛，在國外十分暢銷。蒸煮液是金槍魚罐頭加工過程中產生的廢棄物，富含大量蛋白質、核苷酸、氨基酸等營養成分和風味物質[1]。由于加工技術的限制導致蒸煮液大量流失，不僅造成了極大的資源浪費，而且給企業污水處理增加了成本[2]。因此，對金槍魚蒸煮液的高值化利用是金槍魚加工企業亟待解決的問題。

目前，國內對金槍魚蒸煮液在食品領域的應用研究不多。楊小克等[3]、何鍵東等[4]采用酶解法從金槍魚蒸煮液中提取魚油；陳啟航等[5]采用酶解蒸煮液法制備風味海鮮調味汁；李可欣等[6]以金槍魚蒸煮汁為原料研制金槍魚風味沙拉醬。然而研究發現酶解法不易消除其固有的腥味[7?8]，酵母是一種天然發酵劑[9]，具有較好的脫腥效果[10?11]和重金屬離子吸附作用[12]，目前已有一些研究將活性干酵母應用到海鱸魚片、草魚、牡蠣酶解液、鱘魚肉等脫腥工藝上[13?16]。本文以金槍魚蒸煮液為原料，加入酵母進行發酵制備海鮮調味品基料，通過響應面設計確定最佳發酵工藝，對最優條件下的發酵液進行氨基酸組成分析，以期為金槍魚蒸煮液的深度加工利用以及調味品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金槍魚蒸煮液 浙江省舟山市某金槍魚罐頭加工企業；無水乙醇、乙酸、無水乙酸鈉、甲醇、乙酰丙酮等 均為分析純；活性干酵母：黃酒酵母、啤酒酵母、葡萄酒酵母、復合功能菌酵母 安琪酵母股份有限公司；面包酵母 樂斯福有限公司；71B 酵母 曼森商貿有限公司。

AR224CN 電子分析天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；CT14RDⅡ高速臺式冷凍離心機 上海天美科學儀器有限公司；RE-52AA 旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；智能恒溫培養振蕩器 天津歐諾儀器股份有限公司；PEN 3 型電子鼻 德國Airsense公司；L-8900 全自動氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 單因素實驗 本實驗選用感官評定、電子鼻分析、氨基酸態氮含量三項指標來評估酵母種類、酵母添加量、時間、鹽度對發酵的影響。感官評定可以較為直觀地反映人對不同條件發酵液的接受程度[17]，電子鼻主要通過氣味指紋信息對氣體或揮發性成分做定性或定量的檢測[18?19]，可對感官評定結果進行驗證，氨基酸態氮含量的高低表示游離氨基酸的豐富程度，也可在一定程度上反應物質風味特點[20?21]。

1.2.1.1 酵母種類 分別取30 mL 鹽度為0.20 mol/L的待發酵液，按2‰的添加量加入黃酒酵母、啤酒酵母、葡萄酒酵母、71B 酵母、面包酵母、復合功能菌酵母，置于35 ℃條件下反應12 h，隨后進行感官評定、氨基酸態氮測定、電子鼻分析。

1.2.1.2 酵母添加量 分別取30 mL 鹽度為0.20 mol/L的待發酵液，按不同的添加量（w/v，2‰、4‰、6‰、8‰）加入71B 酵母，置于35 ℃條件下反應12 h，隨后進行感官評定、氨基酸態氮測定、電子鼻分析。

1.2.1.3 發酵時間 分別取30 mL 鹽度為0.20 mol/L的待發酵液，按4‰的添加量加入71B 酵母，置于35 ℃條件下分別發酵6、12、18 h（預實驗發現發酵24 h 和36 h 后，發酵液呈現明顯的硫化氫臭味，故未對該時間發酵液進行其他指標測定），隨后進行感官評定、氨基酸態氮測定、電子鼻分析。

1.2.1.4 鹽度 分別取30 mL 不同鹽度（0.15、0.25、0.35、0.45 mol/L）的待發酵液，按4‰的添加量加入71B 酵母，置于35 ℃條件下反應12 h，隨后進行感官評定、氨基酸態氮測定、電子鼻分析。

1.2.2 響應面設計 在單因素實驗的基礎上，以感官評分為評價指標，選取酵母添加量、發酵時間、鹽度3 個因素進行Box-Behnken 設計，各因素水平見表1。

表1 響應面試驗設計Table 1 Response surface design

1.2.3 感官評定 參考靳艷芬等[22]對鮑復合調味品的感官評定方法，由10 位評價人員組成評價小組對樣品進行感官評定，評定采用1～10 分制，取10 名評價人員的平均分數為最終結果。感官評分參照調味料行業標準，以總體可接受度為最終評價結果，從產品色澤、香氣、滋味（權重比為3:4:3）進行感官評定，感官評分標準見表2。

表2 感官評分標準Table 2 Sensory scoring standards

1.2.4 電子鼻分析 參考吳靖娜[23]的方法并做適當修改，電子鼻傳感器陣列由10 個金屬氧化物傳感器組成：1 號傳感器W1C 對芳香成分靈敏；2 號傳感器W5S 對氮氧化合物很靈敏；3 號傳感器W3C 對氨水、芳香成分靈敏；4 號傳感器W6S 對氫氣有選擇性；5 號傳感器W5C 對烷烴芳香成分靈敏；6 號傳感器W1S 對甲烷靈敏；7 號傳感器W1W 對硫化物靈敏；8 號傳感器W2S 對乙醇靈敏；9 號傳感器W2W 對芳香成分、有機硫化物靈敏；10 號傳感器W3S 對烷烴靈敏。

測定條件為：傳感器清洗時間100 s，歸零時間10 s，樣品準備時間5 s，樣品測試時間150 s，內部流量300 mL/min。選取測定過程中144～146 s 的數據用于后續分析。

1.2.5 氨基酸態氮含量測定 氨基酸態氮含量參考GB 5009.235-2016《食品中氨基酸態氮的測定》[24]第二法測定。

氨基酸態氮增量采用式（1）計算：

其中，Y 為氨基酸態氮增量，A1為發酵后氨基酸態氮含量，A0為發酵液初始氨基酸態氮含量。

1.2.6 氨基酸組成分析 氨基酸組成參考GB/T 5009.124-2016《食物中氨基酸的測定》[25]，使用氨基酸分析儀進行測定。

1.3 統計與分析

實驗結果采用平均值±標準差表示，每個實驗平行3 次。采用Excel 和Design Expert 8 數據處理系統進行數據分析，利用Origin 8.5 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 酵母種類對發酵的影響 由圖1A 可知，71B 酵母發酵后體系感官評分最高，結合電子鼻分析可知，71B 酵母對傳感器2、6 的響應值較小，說明經71B 酵母發酵后，發酵液中氮氧化合物和甲烷含量較低，從而呈現較好的風味。雖然黃酒酵母和啤酒酵母發酵液的氨基酸態氮含量較高，但在發酵過程中也產生了乙醇，使得感官評分較低。因此，選擇71B 酵母用于后續發酵，并對其發酵條件進行優化。

圖1 酵母種類對發酵的影響Fig.1 The effect of yeast type on fermentation

2.1.2 酵母添加量對發酵的影響 由圖2A 可知，酵母添加量為4‰時，感官評分最高，添加量超過4‰后，感官評分呈現下降趨勢，可能因為酵母濃度的增加，引起微生物的競爭性抑制，減緩了腥味物質的分解[11]。結合圖2B，酵母添加量為4‰的發酵液對傳感器2、7、9 的響應值均最小，說明發酵液中氮氧化物、硫化物最少。氨基酸態氮含量的變化與感官評分一致，在4‰時最高。

圖2 酵母添加量對發酵的影響Fig.2 The effect of added yeast on fermentation

2.1.3 發酵時間對發酵的影響 由圖3A 可知，隨發酵時間延長，體系感官評分呈現先增加后降低的趨勢，結合電子鼻分析（圖3B）可知，隨發酵時間延長，體系中氮、硫化物含量非常高，呈現不愉悅的氣味。由圖3C 可知，發酵時間為12 h 時，氨基酸態氮含量最高。發酵過程中蛋白質逐漸被降解成肽、氨基酸和其他小分子，但發酵后期隨著降解的進行，部分小分子肽、氨基酸被繼續分解成氮氧化物，從而導致氨基酸態氮的含量減少，感官評分降低[26]。因此，發酵時間選擇12 h 作為最優條件。

圖3 發酵時間對發酵的影響Fig.3 The effect of fermentation time on fermentation

2.1.4 鹽度對發酵產物的影響 由于不同批次不同廠家的蒸煮液中含鹽量（以NaCl 計）存在差異，且鈉鹽的濃度會影響微生物的生長代謝，進而影響蛋白質的降解[27?28]。因此，研究蒸煮液鹽度對發酵脫腥工藝的影響十分重要。由圖4 可知，鹽度為0.25 mol/L時，樣品的感官評分和氨基酸態氮增量最高，發酵效果最好。且在此條件下，體系對傳感器2、7、9 的響應值較小。前期實驗結果表明當蒸煮液鹽度為0.3 mol/L 和0.25 mol/L 時，其發酵液感官評分差距較小，而蒸煮液實際鹽度為0.3 mol/L，因此響應面試驗的鹽度以0.3 mol/L 為中心點。

圖4 鹽度對發酵產物的影響Fig.4 The effect of salinity on fermentation products

2.2 響應面設計優化

2.2.1 響應面試驗結果 結合單因素實驗可知，氨基酸態氮含量和感官評分結果具有一定的相關性，且不同鹽度的初始氨基酸態氮含量不同，在響應面不同設計組中不易表征，因此以感官評分為評價指標，選擇酵母添加量、發酵時間、鹽度三因素三水平，進行Box-Behnken 試驗設計和響應面分析，以確定海鮮調味基料的最佳制備工藝條件，試驗設計及結果見表3。

表3 響應面試驗結果Table 3 The test results of response surface

2.2.2 方差分析 由表4 可知，P=0.0014 可知模型極顯著（P<0.01），失擬項P=0.1256，差異不顯著（P>0.05），決定系數R2=0.9428。各因素對感官評分的影響依次為B（發酵時間）>C（鹽度）>A（酵母添加量）。其中，模型的極顯著因子項（P<0.01）有B、AC、B2和C2，顯著的因子項（P<0.05）為C，可知感官評分受發酵時間的影響最大。

表4 方差分析結果Table 4 The ANOVA results

2.2.3 響應面分析 響應面圖是回歸方程的圖形表述，從響應面圖中可快速找到最佳參數[29]。由圖5可知，各因素對響應面的陡峭程度影響由大到小依次為：發酵時間>鹽度>酵母添加量，這與方差分析結果一致。當酵母添加量固定不變時（圖5A），隨發酵時間延長，發酵液感官評分呈現先升高后下降的趨勢；當鹽度固定不變時（圖5B），酵母添加量小于4.5‰時，感官評分上升，添加量超過4.5‰時，感官評分隨即下降；當發酵時間固定不變時（圖5C），隨著鹽度的增加，發酵液感官評分也是先上升后下降。

圖5 各因素交互作用的響應面圖Fig.5 Response surface map of the interaction of various factors

2.2.4 最佳工藝條件的預測與驗證 由Design-Expert 8.0 軟件預測得出發酵制備海鮮調味基料最優工藝條件為：酵母添加量4.5‰，發酵時間6 h，鹽度0.26 mol/L，感官評分9.45。在修正條件下進行3 次平行驗證實驗，感官評分9.31±0.32。與理論預測值相符，說明該優化結果可靠，可進一步利用開發為新型調味品。

2.3 氨基酸組成分析

蒸煮液經酵母發酵后，其中一部分蛋白質可水解為低分子肽類和氨基酸[30]。氨基酸是一種重要的呈味物質，氨基酸組成與滋味的形成關系密切。根據氨基酸的味覺強度可大致分為鮮味、甜味、苦味和無味四大類[31]。同時氨基酸還可作為美拉德反應的前體物質，與糖作用生成特殊的香味物質[32]。因此，游離氨基酸是衡量發酵產品風味的一個重要指標。

上述實驗發現71B 酵母發酵后發酵液的感官評分最高，這與其呈味氨基酸的變化密切相關。如表5所示，發酵后溶液中天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）等幾種呈味氨基酸的含量均有明顯上升，其中Gly 和Glu 的含量相對較高，使發酵液呈現柔和的甜味和較強的鮮味。此外，纈氨酸（Val）、組氨酸（His）的含量明顯下降，可能是微生物生長繁殖利用，或是與發酵體系中的還原糖發生了美拉德反應，從而導致其含量降低。由于Val 和His是苦味氨基酸，所以其含量的降低也有利于發酵液呈現較好的風味。

表5 發酵液中的氨基酸組成Table 5 The amino acid composition of fermentation products

3 結論

金槍魚蒸煮液發酵制備海鮮調味品基料的最佳工藝條件為：酵母71B，酵母添加量4.5‰，發酵時間6 h，鹽度0.26 mol/L，最優條件下，感官評分9.31±0.32，與理論預測值相符。對發酵液進行氨基酸組成分析，發現其天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸含量明顯上升，纈氨酸、組氨酸含量明顯下降。研究結果表明蒸煮液經酵母發酵后可用于制備海鮮調味品基料，并且該發酵工藝簡單，適合在產業中應用，從而提升金槍魚蒸煮液的附加值。