高效液相色譜法測定羅城“桂葡1 號”毛葡萄釀酒過程中9 種酚類物質的變化

郝俊光，梁振榮，銀 書，林敏清，龍玉鳳，唐 越，梁城杰，陳 靜,*

（1.北部灣大學食品工程學院，欽州市食品風味分析與調控重點實驗室，廣西欽州 535011；2.廣西天龍泉酒業有限公司，廣西河池 546400）

毛葡萄（Vitis quinnquangularisRehd）是中國三大野生葡萄資源之一[1]，其根系發達，抗旱、耐貧瘠、耐濕熱高溫、抗病性強，適合在石漠化的山區種植，可以幫助南方山區農民增收致富[2]。毛葡萄漿果富含氨基酸、微量元素、多種維生素、多酚類物質和SOD 抗衰老元素等，抗氧化活性較高[3]，適合釀制葡萄酒[4]。國內各省利用當地毛葡萄野生種質資源進行了種質創新，培育出了許多釀酒葡萄新品種，例如兩性花毛葡萄改良新品種“NW196 ”、“野釀2 號”、“桂葡1 號”、“桂葡2 號”、“云葡1 號”等，為毛葡萄酒的優質化和多樣性釀造奠定了基礎[4]。

酚類物質組成復雜多樣，主要包括類黃酮類物質和非類黃酮類物質。其中類黃酮類物質又分為花色苷、黃烷醇類、黃酮醇類以及它們的衍生物；非類黃酮類物質又分為酚酸、芪類物質以及它們的衍生物[5]。類黃酮化合物是一類天然抗氧化物，具有抗氧化、抗炎癥、抗癌、軟化血管等保健功能，對葡萄酒的色澤、感官品質也起重要作用[6?8]。葡萄酒中酚酸類化合物含量豐富，具有抗氧化、抗炎、抑菌、抗糖尿病、抗癌等生物活性[8?10]。白藜蘆醇作為葡萄的主要芪類物質，是一種天然的植物抗毒劑，具有抗腫瘤、防心血管疾病、消炎、殺菌、防衰老等功能[8,11]。花色苷是葡萄酒的主要呈色物質，而其它酚類物質起不同的輔色作用[8,12]。葡萄中的酚類物質主要分布在果皮中，其次是種子和果肉中[13?14]。葡萄酒的酚類物質雖然源自葡萄，但具體組成成分和含量受到品種[15?16]、農事[17?18]、釀造工藝[19?21]、陳化工藝[22]等的影響。目前，酚類物質的檢測手段較多，而反相液相色譜一直是檢測主要酚類物質的首選[5,23?25]。隨著高精度質譜的應用，葡萄酒中越來越多的新酚類物質被認識[8,25?26]。

羅城毛葡萄2016 年獲國家農產品地理標志認證[27]，而“桂葡1 號”是廣西農科院通過歐美釀酒葡萄和羅城野生毛葡萄雜交得到的適合南方氣候種植的優質兩性花釀酒葡萄[28]，已在當地推廣種植上萬畝。深入研究毛葡萄釀酒過程中主要酚類物質的組成和變化，對生產優質毛葡萄酒產品十分重要。目前關于毛葡萄釀酒工藝的報道較多[4,28?29]，但對毛葡萄釀酒過程酚類物質的變化研究較少[28]。本研究擬采用Waters Atlantis? T3 反相色譜柱開發包括蘆丁、反式白藜蘆醇等9 種代表性酚類物質的檢測方法，進而對兩個發酵溫度下“桂葡1 號”毛葡萄釀酒過程中酚類物質的變化進行跟蹤，以期為“桂葡1 號”毛葡萄釀酒提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

“桂葡1 號”毛葡萄 廣西大益生態酒業有限公司提供，糖度11.5 °Brix、色澤紫黑、籽粒飽滿、無霉爛損傷；焦亞硫酸鉀、白砂糖、通用果酒酵母 食品級，煙臺帝伯仕有限公司；UT 高溫型復合果膠酶食品級，諾維信（中國）生物技術有限公司；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、綠原酸、阿魏酸、虎杖苷、蘆丁、水楊酸、白藜蘆醇、槲皮素、山奈酚、乙腈、乙酸 均為色譜純，上海麥克林生化科技公司。

Waters Atlantis? T3 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Waters Alliance 2695HPLC 分離單元、2996 PDA 檢測器、Empower 工作站 美國Waters 儀器公司；DK-98-II 電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；Eppendorf INNOVA43R 落地式低溫搖床 美國New Brunswick 生命科學儀器及設備公司；H1850 高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；ME204E 電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Cascada I 實驗室超純水系統 美國PALL 公司；0.22 μm SLGP 033RB 針頭濾膜 美國Millipore 公司；5 L 不銹鋼發酵罐 煙臺帝伯仕有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 毛葡萄酒的發酵 工藝流程[21,28]：除梗→洗凈→稱量→護色擠汁→酶解→活化酵母、接種→調糖→裝罐→開始控溫發酵→每天“壓帽”三次→3 d 后倒罐→發酵15 d

操作要點為：

護色擠汁：往洗凈的3 kg 毛葡萄中加入0.6 g焦亞硫酸鉀，使焦亞硫酸鉀達到200 mg/L，破碎擠汁，裝入帶取樣龍頭的5 L 不銹鋼發酵罐中。

酶解：在毛葡萄漿中加入300 μL 復合果膠酶（UT），然后在50 ℃的水浴鍋中酶解2 h。

活化酵母與接種：將0.6 g 通用果酒酵母加入100 mL 5%的糖水,然后在30 ℃水浴鍋中活化30 min，接種到葡萄漿中。

調糖：在接種的葡萄漿中加入白沙糖320 g 使糖度調至 22 °Brix，封蓋，并在發酵栓中加水。

發酵：將不銹鋼發酵罐置于恒溫培養箱中，分別在22、28 ℃下發酵，發酵第3 d 通過取樣龍頭進行皮渣分離并倒罐至新的發酵罐中。每個溫度進行兩個發酵平行實驗。

1.2.2 定性標準溶液的配制 稱取適量物質，用去離子水配制成矢車菊素-3-O-葡萄糖苷48 mg/L、綠原酸8 mg/L、阿魏酸8 mg/L、虎杖苷8 mg/L、蘆丁80 mg/L、水楊酸40 mg/L、反式白藜蘆醇8 mg/L、槲皮素8 mg/L、山奈酚8 mg/L 的單標，用于不同酚類物質保留時間和峰形的確定。將上述單標溶液等體積混合后用于色譜條件的優化，在不同色譜條件下色譜峰的辨識基于單標所獲取的峰形、強度和出峰順序。

1.2.3 色譜的基本操作條件 色譜柱：Waters Atlantis?T3 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A：乙腈溶液；流動相B：1%乙酸溶液；洗脫方式：線性梯度；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：280、306、320、360 nm。

1.2.4 色譜條件的優化和酚類物質的定性 色譜條件的優化包括各物質的定量波長的確定和梯度洗脫條件（見表1）的優化。首先在梯度二條件下進行各物質在270～400 nm 波長下的紫外二極管陣列掃描，選取適宜的較大吸收波長作為該物質的檢測波長。然后，對混合定性標準樣品在選定的檢測波長下進行分離優化，共進行了10 余次調整，僅以表1 中列出的3 個洗脫梯度說明優化效果。將各目標物完全分離、檢測周期短的洗脫梯度作為優化的色譜條件，并確定各酚類物質在優化條件下的保留時間，完成目標物的定性。

1.2.5 混合標準儲備液的配制 稱取各種標準品適量，配制成高濃度母液，再用移液槍移取適量母液于100 mL 容量瓶，用去離子水定容至刻線，得到綠原酸300 mg/L、阿魏酸50 mg/L、虎杖苷50 mg/L、蘆丁500 mg/L、水楊酸250 mg/L、反式白藜蘆醇50 mg/L、槲皮素50 mg/L、山奈酚50 mg/L 的混合標準儲備液；稱取6 mg 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷于1.5 mL 的樣品瓶中，加去離子水配制成濃度為6000 mg/L 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷儲備液。

1.2.6 標準曲線的建立 依次分別吸取0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mL 混合標準儲備液以及5、10、20、40、80、160 μL 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷儲備液于6 個10 mL 容量瓶中，用去離子水定容，得到6 個混合標樣的濃度梯度。在優化的條件下對濃度梯度1～6 由低到高進行檢測，將峰面積（Y）和濃度（x）進行強制過原點的線性擬合，建立標準曲線。

1.2.7 定量方法的方法學評估 把最低濃度標準溶液逐步稀釋檢測，分別取信噪比等于3 和10 時對應分析物的濃度作為檢出限和定量限。取標樣梯度3 重復進樣6 次，計算各酚類物質的相對標準偏差。取兩份相同的毛葡萄果酒的樣品，其中一份加入濃度梯度2、4、6 標準混合溶液，平行測定六次，計算出相應組分的加標回收率。

1.2.8 發酵過程酚類物質變化的跟蹤 利用所建立的HPLC 檢測方法對酚類物質在22 ℃和28 ℃發酵變化進行跟蹤，分別取第0、3、6、9、12、15 d 的樣品進行檢測。樣品經0.22 μm 針頭濾膜過濾后直接上樣檢測，每個溫度的兩個平行發酵均進行跟蹤，每個取樣點的樣品進行三次重復測定。

1.3 數據處理

使用Microsoft Excel 2016 軟件對數據進行處理，數據以兩次實驗的六個檢測數據的平均值±標準偏差形式表示。

2 結果與分析

2.1 HPLC 色譜條件的優化

對12 mg/L 的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、12 mg/L的綠原酸、2 mg/L 的阿魏酸、2 mg/L 的虎杖苷、20 mg/L 的蘆丁、10 mg/L 的水楊酸、2 mg/L 反式白藜蘆醇、2 mg/L 槲皮素、2 mg/L 山奈酚的混標按線性洗脫梯度三進行了270～400 nm 的掃描，結果如圖1 所示。矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、綠原酸、阿魏酸、虎杖苷、蘆丁、水楊酸、反式白藜蘆醇、槲皮素、山奈酚檢測的最大吸收波長分別是279、324、322、317、353、299、317、364、364 nm。為簡化定量過程，選定定量波長依次為280、320、320、320、360、306、320、360、360 nm。

圖1 九種酚類物質標樣270～400 nm 的HPLC 二極管陣列光譜圖Fig.1 HPLC diode array spectrograms of nine phenols at 270～400 nm

表1 列出的3 個有代表性的洗脫梯度對應的洗脫效果見圖2。由于各物質在280 nm 均有檢出，色譜峰分離效果均以280 nm 色譜圖說明。采用梯度一洗脫時，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（峰1）與綠原酸（峰2）以及阿魏酸（峰3）、虎杖苷（峰4）與蘆丁（峰5）均未完全分開（見圖2A）。采用洗脫梯度二時，阿魏酸（峰3）、虎杖苷（峰4）與蘆丁（峰5）已完全分離，但矢車菊素-3-O-葡萄糖苷與綠原酸分離效果仍不理想，二者的分離度僅為1.17（見圖2B）。為此，將乙腈濃度達到16%的時間由28 min 改為梯度三的26 min，使二者的分離度達到1.53，實現了完全分離（見圖2C）。另外，梯度三使最后出峰的山奈酚的保留時間由56.1 min 提前到53.3 min，提高了檢測效率。最終確定梯度三為最優梯度。

圖2 九種酚類物質標樣三個梯度下的280 nm HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of 9 phenolic compound standards at 280 nm under three gradients

表1 優化過程所采用的三種洗脫梯度Table 1 The comparison of the three eluent gradients adopted in the optimization process

2.2 9 種酚類物質的定性

在優化的條件下，進行完成9 種酚類物質的定性，在4 個檢測波長下的色譜圖見圖3，確定的保留時間見表2。

圖3 優化條件下9 種混合標準品在四個檢測波長的HPLC 譜圖Fig.3 Chromatograms of 9 phenolic compounds at 4 detected wavelengths under optimum conditions

2.3 標準曲線建立及方法的評價

在優化的條件下對6 個混合標準梯度進行檢測，將峰面積（y）和濃度（x）進行強制過原點的線性擬合，建立標準曲線，進行方法評價。標準曲線及其線性范圍與R2、檢出限、定量限、加標回收率、相對標準偏差的結果見表2。結果顯示，該方法的線性范圍較寬，標準曲線線性相關系數0.989～0.999；檢出限0.017～0.296 mg/L，定量限0.056～0.987 mg/L，混合標樣梯度4 對應的加標回收率92.37%～103.45%，相對標準偏差0.25%～3.26%，說明該方法線性良好，精密度和準確度高，可用于葡萄酒發酵液的檢測。

表2 九種酚類物質的保留時間、檢測波長及定量方法的評價Table 2 Evaluation of retention time,measure wavelength and quantitative methods of 9 phenolic compounds

2.4 發酵過程酚類物質的變化

溫度對發酵的劇烈程度有明顯的影響[21]，利用所建立的HPLC 檢測方法對酚類物質在22 ℃和28 ℃發酵15 d 的發酵液中變化進行跟蹤，以期明確較大的溫度差異對酚類物質的影響。為使表述更清晰，將所測9 種酚類物質按結構分類順序進行討論，即酚酸類（綠原酸、阿魏酸、水楊酸）、花色苷類（矢車菊素-3-O-葡萄糖苷）、芪類物質（反式白藜蘆醇、虎杖苷）、黃酮醇類（山奈酚、槲皮素、蘆丁）的順序進行討論[5]。

2.4.1 綠原酸、阿魏酸、水楊酸的變化 綠原酸屬于對羥基苯甲酸型酚酸，水楊酸和阿魏酸屬于對羥基肉桂酸型酚酸[5]，三者的變化趨勢不一致（見圖4）。水楊酸呈現先降后升然后緩慢趨穩的趨勢；綠原酸一直呈下降趨勢；阿魏酸呈先升后降的趨勢。葡萄漿果中酚酸以游離和結合兩種形式存在，其中游離態占20%～25%[15]，果肉中游離酚酸的含量高于果皮中[30]。三者不一致的變化趨勢說明不同酚酸物質在發酵過程中經歷了不同的浸提、水解、加合、轉化等過程。溫度對發酵過程略有影響，但15 d 時兩個溫度發酵液的水楊酸、綠原酸含量差異不大。15 d 發酵液中水楊酸含量約是魏巍等所報道的“桂葡1 號”葡萄酒的三分之一[28]，可能與二者所采用的皮渣分離時間、酵母、葡萄的農事等差異有關。

圖4 發酵過程水楊酸、綠原酸、阿魏酸的含量變化Fig.4 Content change of salicylic acid, chlorogenic acid,ferulic acid during fermentation

2.4.2 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的變化 葡萄酒中的花色苷種類很多，包括基本花色苷、酰化花色苷、吡喃花色苷和聚合花色苷[12]，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷是葡萄酒中含量豐富的基本型花色苷[24]。矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的變化見圖5，呈先升后降趨勢，與文獻報道一致[15]。前期上升主要是浸提的結果，而后期下降可能是發生了水解、聚合或加合反應（如吡喃花色苷Vitisins 生成）[15,22,26]。

由圖5 可知，不同發酵溫度對矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的變化以及發酵結束時的含量影響較明顯。28 ℃的峰值高但后期下降也明顯，在發酵結束時比22 ℃含量低。相對于初始發酵液，15 d 發酵結束時22、28 ℃的含量分別提高了109%和92%。發酵過程矢車菊素-3-O-葡萄糖苷呈增加趨勢，與花色苷是葡萄酒的主要顏色來源的觀點相符[12]。

圖5 發酵過程矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的含量變化Fig.5 Content change of cyandin-3-O-glucoside during fermentation

2.4.3 反式白藜蘆醇與虎杖苷的變化 反式白藜蘆醇和虎杖苷是葡萄酒中主要芪類物質，變化趨勢見圖6。由圖6 可知，反式白藜蘆醇在發酵過程呈先升后降的趨勢；兩個發酵溫度前期差別不大，均在發酵第6 d 到達峰值，后期均下降，28 ℃的降幅相對較大；其15 d 發酵液的含量低于初始發酵液。發酵液中反式白藜蘆醇的下降可能與酵母的吸附、對應糖苷的分解以及順反異構的互相轉化有關[20?21]。虎杖苷在發酵過程中一直下降，可能與酶促水解作用較強烈有關[20]，28 ℃發酵液的前期降幅更明顯。

圖6 發酵過程反式白藜蘆醇與虎杖苷的含量變化Fig.6 Content change of trans-resveratrol and polydatin during fermentation

2.4.4 山奈酚、槲皮素、蘆丁的變化 山奈酚、槲皮素、蘆丁是葡萄酒中主要的黃酮醇類物質，發酵過程中山奈酚和槲皮素呈現先升后降再趨穩的變化（見圖7），峰值出現在第6 d，相同發酵時間28 ℃發酵液的含量均高于22 ℃發酵液的含量。山奈酚、槲皮素的前期增加可能與酵母分泌的β-葡萄糖苷酶引發對應的糖苷水解有關[20]。蘆丁也呈先升后降趨勢（見圖7），峰值在第3 d，其前期的增加可能與浸提有關，后期的下降可能是被糖苷酶水解的原因[20]。15 d發酵液中蘆丁和槲皮素含量明顯低于魏巍的報道水平[28]，可能與所采用的原料、酵母、工藝的不同有關。

圖7 發酵過程山奈酚、槲皮素、蘆丁的含量變化Fig.7 Content change of kaempferol, quercetin, rutin during fermentation

3 結論

利用反相高效液相-紫外二極管陣列法建立了9 種酚類物質的定量分析方法。該方法的線性范圍寬、檢出限低、加標回收率高、精密度好。對“桂葡1 號”毛葡萄在22 ℃和28 ℃發酵過程中的酚類變化進行了跟蹤，確定了不同酚類物質的變化規律。除虎杖苷和綠原酸一直呈下降趨勢外，其它酚類物質的變化均呈先升后降的趨勢。兩個發酵溫度的變化趨勢基本一致，只是幅度不同。在符合先升后降的酚類物質中，除矢車菊素-3-O-葡萄糖苷外，兩個溫度的發酵曲線中峰值高的溫度對應的15 d 發酵液中相應物質含量也高。

本研究為葡萄酒典型酚類物質的檢測和大生產品質控制提供了一個有效手段，釀造過程的探討為毛葡萄酒的優質化生產提供了前期的數據。但鑒于酚類物質的復雜性和影響因素的多變性，尚需要借助液質等先進手段對毛葡萄酒中的酚類物質進行深入的探究。