海參皂苷Holothurin A 和Echinoside A 對肥胖小鼠尿酸代謝的影響

巨盛楠，徐慧靜,2，王玉明,3，李兆杰，薛長湖,3，張恬恬,*

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266003；2.永嘉縣市場監督管理局，浙江溫州 325100；3.青島海洋科學與技術試點國家實驗室，山東青島 266237）

隨著膳食結構和飲食生活習慣的變化，肥胖人群的比率呈逐年上升趨勢。除糖、脂代謝異常外，肥胖患者存在明顯的尿酸代謝紊亂[1?3]。尿酸代謝異常通常表現為體內尿酸水平升高[4?6]，臨床治療困難，目前不能完全置治愈。因此，有必要篩選安全有效、天然來源的功能性食品成分預防肥胖引起的尿酸代謝異常。

尿酸代謝異常與肝臟尿酸合成增多及腎臟尿酸分泌減少密切相關[4]。皂苷是一類苷元為三萜或螺旋甾烷類化合物的糖苷。文獻報道皂苷具有改善腎臟損傷的作用，但并沒有深入研究皂苷對尿酸代謝的影響[7?8]。海參成分復雜，皂苷是海參的主要次級代謝產物[9]。海參皂苷結構上具有明顯區別于陸地來源皂苷的硫酸酯化基團。前期研究發現海參總皂苷可顯著降低高嘌呤飲食誘導的小鼠血尿酸水平[10?11]。Holothurin A（HA）和Echinoside A（EA）是海參總皂苷中含量較高的兩種單體[12?15]。二者結構相似，均為海參烷型三萜皂苷，其母核的20 位C 原子上鏈有6 個碳原子的側鏈，但HA 側鏈上存在環氧結構[15]。目前關于HA 與EA 在體內調節尿酸代謝的構效關系尚未報道。

db/db 小鼠是一種自發肥胖性代謝綜合征模型[16?17]，本研究比較海參皂苷單體HA 和EA 對db/db肥胖小鼠尿酸代謝的影響，為海參皂苷的開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF 級雄性C57/BL6 小鼠、db/db 小鼠體重（20±2）g 南京君科生物工程有限公司；海參皂苷單體HA 和EA 均由中國海洋大學食品科學與人類健康實驗室提供，純度為91%，結構如圖1 所示；尿酸、尿素氮、肌酐、黃嘌呤氧化酶、腺苷脫氨酶試劑盒 南京建成生物科技有限公司；伊紅 上海試劑三廠；蘇木精 上海藍季科學發展有限公司；MMLV逆轉錄酶 美國Promega 公司；dNTP 大連寶生物工程有限公司；RNAase inhibitor 美國Roche 公司；EvaGreen 2X qPCR MasterMix 愛必夢生物科技有限公司；Random Primer 上海生工生物工程股份有限公司；其他的生化試劑 均為國產分析純。

圖1 海參皂苷Holothurin A 與Echinoside A 結構Fig.1 Structure of Holothurin A and Echinoside A

Spark 10M 型酶標儀 瑞士帝肯公司；UV-2550 型分光光度計 上海元析儀器有限公司；Neofuge 23R 型臺式離心機 上海力新儀器有限公司；BH–200 型光學顯微鏡 舜宇光學科技有限公司；H–7000 型透射電鏡 日本日立公司；IQ5 型Realtime PCR 儀 美國Bio-Rad 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及飼料配制 將雄性db/db 小鼠按體重隨機分成3 組，分別是模型組、海參皂苷HA 組（HA）、海參皂苷EA 組（EA），每組8 只，C57/BL6 小鼠為正常對照組。動物飼料配方以AIN-93 配方為基礎并加以調整，海參皂苷HA 和EA 組在模型組飼料的基礎上減少玉米淀粉的添加量，再分別添加0.07%的海參皂苷單體HA 和EA，飼料成分如表1所示。

表1 動物實驗飼料的成分Table 1 Compositions of experimental diets

1.2.2 動物實驗 各組小鼠在環境溫度（23±2） ℃、相對濕度65%±15%的條件下自由地進食和飲水，適應性喂養2 周，每日記錄其體重及攝食量。干預2 周后稱重，眼球取血，致死，立即解剖并迅速地取出肝臟、腎臟，稱重后經液氮速凍保存于?80 ℃冰箱備用。解剖過程中取2 份腎臟組織分別迅速投入10%中性甲醛和4%戊二醛溶液中固定，用于制備切片。

1.2.3 腎臟生化指標測定 血液在室溫靜置30 min后，離心（2000×g，15 min）后得到血清，按照試劑盒說明分別測定血清尿酸水平、血清肌酐水平、血清尿素氮水平。

1.2.4 肝臟酶活測定 取小鼠肝臟勻漿取上清液，通過比色法測定肝臟黃嘌呤氧化酶（Xanthine Oxidase，XOD）和腺苷脫氨酶（Adenosine Deaminase，ADA）的活性，按照試劑盒說明書測定。

1.2.5 腎臟切片光學顯微鏡觀察 將10%中性甲醛固定的腎皮質由石蠟包埋制成4 μm 切片，經蘇木精、伊紅染色后于光學顯微鏡下觀察和拍照。

1.2.6 腎臟切片透射電鏡觀察 用4%戊二醛溶液固定的腎皮質制備切片，于電鏡下觀察腎小球的形態結構。

1.2.7 腎臟尿酸代謝相關基因mRNA 測定

1.2.7.1 總RNA 提取 取0.1 g 腎臟，采用Trizol 法[18]，提取組織總RNA，測定260、280 nm 下吸光值A，計算A260與A280的比值在1.9～2 之間以保證RNA 的高純度，再通過1.2%瓊脂糖電泳結果驗證腎臟RNA 未被降解。

1.2.7.2 RT-qPCR 檢測基因表達量 取1 μg 腎臟總RNA，依照逆轉錄試劑盒的說明書進行逆轉錄，將得到的腎臟cDNA 稀釋到合適的濃度后，用realtime qPCR（RT-qPCR）方法進行測定。PCR 條件為：總反應體系為25 μL，各反應物的用量，參照試劑盒（EvaGreen 2X qPCR MasterMix）說明書進行操作。目的基因產物的專一性驗證通過PCR 擴增結束后進行溶解曲線分析。目的基因mRNA 表達量測定時以18s mRNA 表達量作為內參，并且將對照組設為100%。

所使用引物序列均經過 BLAST 驗證，并由上海生工生物工程有限公司合成，具體引物序列如下表2所示。

表2 RT-qPCR 引物Table 2 Primers sequences used for RT-qPCR

1.3 數據統計處理

數據重復測定三次，取平均值，結果用平均值±標準差示，采用oneway ANOVA 進行統計分析，P<0.05 表示有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 海參皂苷HA 與EA 對小鼠生化指標的影響

由圖2A 可知，相比對照組小鼠，模型組小鼠表現為血清尿酸含量顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，HA 組和EA 組均可顯著降低（P<0.05）小鼠血清尿酸水平，HA 組降低了12.7%，EA 組降低了18.1%，其中EA 組降低血尿酸水平更為顯著，而受試物組與對照組并無顯著差異（P>0.05）。文獻報道尿酸升高的同時肌酐及尿素氮水平也會升高[19?20]。由圖2B可知，模型組小鼠與對照組小鼠血清肌酐水平并沒有顯著差異（P>0.05）。相比對照組小鼠，模型組小鼠尿素氮水平顯著降低（P<0.05）（圖2C）。模型組血清肌酐及尿素氮的結果與文獻報道不一致[19?20]，可能是由于小鼠品系來源并非絕對嚴格對照。db/db 小鼠是由C57/BL KsJ 小鼠近親交配衍化而來，而對照小鼠選用的是C57/BL6小鼠。由圖2C 可知，HA 和EA 可顯著降低模型小鼠尿素氮水平（P<0.05），與相關研究結果一致[10?11]。

圖2 海參皂苷HA 和EA 對血清尿酸、肌酐及尿素氮水平的影響（n=8）Fig.2 Effects of HA and EA on serum uric acid, creatinine and blood urea nitrogen in mice（n=8）

2.2 海參皂苷HA 與EA 對肝臟黃嘌呤氧化酶（XOD）和腺苷脫氨酶（ADA）活性的影響

酶活實驗結果表明（圖3），海參皂苷HA 與EA 干預2 周對db/db 肥胖小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶和腺苷脫氨酶的活性均無顯著影響(P>0.05)，而眾多研究證明XOD 和ADA 是尿酸合成過程的關鍵酶，抑制XOD 與ADA 的活性可以有效降低血清尿酸水平[21?22]。前期研究發現海參中的活性成分如海參多糖、海參皂苷均可以通過抑制XOD 及ADA活性降低高嘌呤飲食誘導的小鼠血尿酸水平[10?11]。

圖3 海參皂苷HA 和EA 對肝臟XOD 和ADA 活性的影響（n=8）Fig.3 Effects of HA and EA on hepatic XOD and ADA activity in mice（n=8）

2.3 海參皂苷HA 與EA 對小鼠腎臟組織形態學的影響

2.3.1 小鼠腎臟組織光學顯微鏡觀察結果 腎臟是尿酸排泄的重要場所之一，人體的2/3 尿酸經腎臟排出[23]。由圖4 可知，在400 倍的光鏡下，對照組正常小鼠腎小球邊界清晰、腎小囊體積均勻（圖4-A）；模型組小鼠腎小球整體體積脹大，膜擴張，邊界模糊，腎小囊體積明顯變小，腎小球內的毛細血管膨脹，并與腎小囊粘連（圖4-B），這與Kosugi 等[24]的研究結果相似；HA 組與EA 組的小鼠，腎小球體積均一、邊界清晰，HA 組與EA 組腎小囊均一且毛細血管有所恢復（圖4-C、4-D），相較模型組病理變化得到改善，與Strippoli 等[25]的研究中腎臟病理改善情況一致。

圖4 HE 染色下小鼠腎臟切片光學顯微鏡觀察（400×）Fig.4 Optical microscope of HE staining renal cortex（400×）

2.3.2 小鼠腎臟組織電鏡觀察結果 在10000 倍電鏡下，觀察小鼠腎小球結構，正常小鼠的腎小球基底膜厚度均勻，足突分布均勻（圖5-A）；模型組小鼠腎小球內皮細胞三層細微結構出現部分消失，足突出現了融合現象，孔窗結構模糊（圖5-B）。海參皂苷HA 和EA 組對足突融合均有所改善，其中HA 組足突均勻分布，孔窗結構有所恢復，但足突融合情況仍存在（圖5-C）；EA 組孔窗結構恢復清晰，足突融合情況得到很大程度地改善（圖5-D）。電鏡觀察結果表明肥胖小鼠的腎小球結構，在喂食海參皂苷HA 和EA 后，針對足突融合現象均有不同程度的改善，且EA 效果優于HA。

圖5 小鼠腎小球電鏡觀察（10000×）Fig.5 Electron microscopic of glomerular in mice（10000×）

2.4 海參皂苷HA 和EA 對腎臟尿酸代謝相關轉運體mRNA 表達的影響

2.4.1 海參皂苷HA 和EA 對葡萄糖轉運蛋白GLUT9 mRNA 表達的影響 由圖6 可知，與對照組比較，模型組小鼠腎臟GLUT9 mRNA 表達略有下降，但無顯著性變化(P>0.05)；與模型組比較，HA 與EA 均可顯著上調小鼠腎臟GLUT9 mRNA 表達，且EA 組與HA組相比更為顯著（P<0.05）。目前許多研究發現尿酸代謝與尿酸轉運蛋白密切相關，尿酸轉運相關蛋白包括尿酸重吸收相關蛋白與尿酸分泌相關蛋白[26]。其中葡萄糖轉運蛋白（GLUT9）是主要的尿酸鹽重吸收轉運蛋白[27?28]，分布在近端腎小管，對尿酸穩態有重要作用[29]。研究發現敲除GLUT9 基因的小鼠，體內尿酸水平明顯升高[30]。此結果表明海參皂苷HA 和EA 在促進腎臟對尿酸的重吸收方面有顯著作用，且EA 顯著優于HA。

圖6 海參皂苷HA 和EA 對腎臟GLUT9 mRNA 表達的影響（n=8）Fig.6 Effects of HA and EA on kidney GLUT9 mRNA level in mice（n=8）

2.4.2 海參皂苷HA 和EA 對有機陰離子轉運體1（OAT1）mRNA 表達的影響 由圖7 可知，模型組小鼠腎臟OAT1 mRNA 表達較對照組顯著降低47.4%（P<0.05）；干預海參皂苷HA 和EA 后，均可顯著（P<0.05）上調模型小鼠腎臟OAT1 mRNA 表達，與模型組相比分別上調了20.1%和127.6%，表明EA 組在調節OAT1 mRNA 表達方面優于HA 組。OAT1 屬于尿酸鹽有機陰離子轉運體（OAT）家族，是與尿酸分泌和排泄密切相關的轉運體，負責轉運有機陰離子[12,31]。有研究表明，高尿酸血癥大鼠模型OAT1蛋白表達顯著下降[32]，與本文模型組小鼠結果一致。該結果表明HA 與EA 可以促進腎臟對尿酸的排泄，且EA 效果顯著優于HA。

圖7 海參皂苷HA 和EA 對腎臟OAT1 mRNA 表達的影響（n=8）Fig.7 Effects of HA and EA on kidney OAT1 mRNA level in mice（n=8）

2.4.3 海參皂苷HA 和EA 對有機陽離子轉運體（OCTs）和肉堿/有機陽離子轉運體（OCTNs）mRNA 表達的影響 由圖8A、8B 可知，模型組小鼠相較對照組OCT1、OCT2 mRNA 表達均顯著性下降（P<0.05），HA 和EA 均可顯著上調模型小鼠腎臟OCT1、OCT2 mRNA 表達（P<0.05），其中HA 組與EA 組無顯著性差異(P>0.05)。由圖8C、8D 可知，與對照組相比，模型組小鼠OCTN1 與OCTN2 mRNA 并無顯著差異(P>0.05)，EA組可顯著上調模型小鼠腎臟OCTN1與OCTN2 mRNA 表達量(P<0.05)，而HA 對模型小鼠并無顯著上調作用(P>0.05)。有機陽離子轉運體（OCT）家族與肉堿/有機陽離子轉運體（OCTN）家族也是影響尿酸代謝的一個重要因素。研究表明，慢性腎功能衰竭的大鼠體內OCT2 及OCTN2 轉運蛋白表達量下降，從而引起腎臟有機陽離子重吸收和分泌受損[33?34]。EA 可同時上調OCTs 及OCTNs mRNA的表達，而HA 僅顯著上調OCTs 的mRNA 表達，表明EA 可以通過調控OCT 尿酸鹽有機陽離子轉運體及OCTN 肉堿/有機陽離子轉運體調節尿酸代謝。

圖8 海參皂苷HA 和EA 對腎臟OCTs 和OCTNs mRNA 表達的影響（n=8）Fig.8 Effects of HA and EA on kidney OCTs and OCTNs mRNA levels in mice（n=8）

3 結論

本研究對海參皂苷單體HA 與EA 在體內調節尿酸代謝的構效關系進行了較為系統的評價。補充海參皂苷HA 與EA 后，db/db 肥胖小鼠血尿酸水平分別降低12.7%和18.1%；腎臟腎小球組織結構病理學變化有了明顯改善；海參皂苷對肥胖小鼠肝臟中XOD 及ADA 酶活無顯著影響(P>0.05)，但顯著上調腎臟尿酸代謝相關轉運體的mRNA 表達水平(P<0.05)。海參皂苷單體HA 與EA 可能通過同時調控尿酸代謝重吸收轉運體GLUT9 與分泌相關轉運體OAT1、OCTs、OCTNs 等改善肥胖小鼠尿酸代謝異常，并顯著改善腎臟組織結構病理學變化，其中EA 改善效果優于HA。由于本研究選用db/db 肥胖小鼠，其具有嚴重的糖尿病癥狀，高血糖可以通過影響腎臟的微循環來間接影響腎功能。因此，海參皂苷直接影響尿酸代謝，還是通過影響糖代謝進而改善尿酸代謝，需進一步開展實驗加以驗證。本研究成果將為膳食海參皂苷預防尿酸代謝異常提供理論依據。