植物類黃酮化合物生物合成調控研究進展

趙 瑩，楊欣宇，趙曉丹，鐘 以

（北京工商大學食品與健康學院，北京 100048）

類黃酮化合物是參與植物發育和防御的次生代謝產物，因其具有抗氧化、清除自由基、抑菌等多種功能而受到廣泛關注，對人類健康有重要意義[1]。類黃酮具有結構和特征多樣性，其化合物基本骨架為C6-C3-C6，兩個苯環通過三個碳原子結合而成，如圖1[2]，根據分子結構可分為6 大類，包括黃酮類、黃酮醇類、黃烷酮類、異類黃酮類、黃烷醇類、花色素類[3]等。類黃酮化合物普遍存在于植物體內的生物合成途徑當中，并產生及其豐富的次生代謝產物[4]，是次生代謝產物中最大的類群之一，是植物色素的主要來源，在植物的各個部位都有積累。發育階段的早晚和環境溫度、濕度的強弱對類黃酮在植物中積累的影響有所不同，它是果蔬氣味、顏色的重要組成部分。此外，類黃酮化合物還有助于提高植物產品的農藝、工業和營養價值。它會影響種子和果實的品質、植物產品的澀味和食品的保健價值[5]。目前，關于類黃酮的研究主要集中在提取、純化、結構鑒定、生理功能等方面，隨著分子生物學的快速發展，越來越多的人開始注重一些外界因素例如輻射、氮素、溫度、酶基因等對于類黃酮化合物合成代謝途徑的調控方面的研究，以期為食品營養以及功能食品和天然產物的開發提供參考[4]。

圖1 類黃酮的結構Fig.1 Structure of flavonoids

1 植物類黃酮化合物合成代謝途徑

類黃酮是多酚類中最大的一類化合物，植物類黃酮合成的起始底物是來自苯丙烷代謝途徑的香豆酰輔酶A 和丙二酰輔酶A，如圖2 所示[2,6]。首先苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（PAL）的作用下生成肉桂酸，肉桂酸在肉桂酸4-羥化酶（C4H）的作用下進一步發生羥基化反應，轉化成香豆酸，然后在4-香豆酸輔酶A 連接酶（4CL）的催化下形成香豆酰輔酶A，香豆酰輔酶A 和丙二酰輔酶A（來自乙酰輔酶A）為前體，二者在查耳酮合成酶（CHS）（此酶催化生成所有類黃酮的查耳酮骨架）的催化下生成查耳酮，接著在查耳酮異構酶（CHI）的異構化作用下生成無色柚皮素，柚皮素作為主要的代謝產物進入其他類黃酮的合成途徑。由于類黃酮化合物的合成途徑在植物中是保守的，所以由于外界因素的不同，許多酶會改變類黃酮的基本骨架，從而生成不同種類的類黃酮化合物[3,7]。

圖2 植物類黃酮生物合成途徑Fig.2 Biosynthesis pathway of plant flavonoids

2 植物類黃酮化合物合成代謝途徑的調控

2.1 外界因素對類黃酮化合物合成的調控

外界環境因素對植物次生代謝起著重要的調控作用，可以引起次生代謝物含量的顯著性改變，這些外界因素包括光照、溫度、水分、輻射、激素、礦物質等。下面對上述因素進行綜述，以期為植物類黃酮的調控提供參考[8]。

2.1.1 光照 光對類黃酮合成的影響體現在光照強度、光照時間和光質等方面，主要通過影響相關酶和基因的活性，從而提高類黃酮的積累量[9]。ZORATTI等[10]對野越桔和高叢藍莓的花青素組成進行研究，發現季節、溫度和光照可以通過影響類黃酮3',5'羥化酶（F3′5′H）基因來影響受測野越桔的花青素含量。ALBERT 等[11]發現大多數植物花色苷的積累與光照強度成正相關，光照強度越強，越容易誘導花色苷合成的結構基因和調節基因的表達，矮牽牛花色素只有在高光照下生長才會出現強烈的著色現象，說明存在一種光誘導調控因子，負責激活花青素途徑。鑒于Lc（一種來自玉米的bHLH 調節因子）和An11（一種WD40 的調節因子）均在矮牽牛中組成性表達，且MYB 花青素調節劑Rosea1 能夠調節光照下矮牽牛花色素的合成，推測內源性調控因子可能是MYB 蛋白[12]。GUAN 等[13]指出在葡萄中遮光處理可以改變花色苷合成和轉運相關基因的表達從而降低其含量，恢復光照后花色苷迅速積累，表明光照對葡萄花色苷的積累起正調控作用。這些調節與花青素生物合成途徑的結構、調控基因表達的改變以及花青素轉運基因的變化有關。XU 等[14]通過對銀杏的不同處理，發現不同的光照強度對銀杏幼苗生物量的積累有顯著影響，100%光照對銀杏葉類黃酮的生物合成和積累起促進作用，PAL、CHS、F3H（黃酮-3-羥化酶）、FLS（黃酮醇合成酶）各種酶表達量也非常高，基因表達水平與類黃酮醇含量呈顯著正相關。AZUMA 等[15]利用離體葡萄漿果進行了體外環境實驗，研究了溫度和光照條件對類黃酮（花青素和黃酮醇）合成及相關基因表達水平的影響，發現低溫（15 ℃）加光照處理下，葡萄果皮花青素積累量充足，而高溫（35 ℃）或暗處理嚴重抑制花青素積累，驗證了低溫對花青素的積累起正調控作用，另外還發現許多類黃酮生物合成相關基因在低溫和光照下均獨立上調，說明低溫和光對類黃酮合成途徑內基因的表達具有協同作用。

2.1.2 溫度 次生代謝物的形成和積累與溫度密切相關，高溫和低溫都會影響植物次生代謝產物酶的活性，低溫更有利于植物類黃酮的生成[4]。KIM 等[16]發現高溫通過E3 泛素連接酶COP1 和擬南芥花青素生物合成的正調控因子（HY5）抑制了擬南芥花青素生物合成，HY5 是花青素合成的正調控因子，但高溫條件下誘導了它的降解，從而抑制了MYBL2 基因的表達，因此引起高溫對花青素生物合成的抑制。環境溫度的升高降低了擬南芥花青素生物合成途徑早期和晚期所需基因的表達，于是他認為高環境溫度通過COP1-HY5 信號模塊抑制花青素的合成，低溫更有利于類黃酮化合物的合成。WANG 等[17]的研究成果也支持了該觀點，通過研究溫度對銀杏葉黃酮量的影響，發現溫度對類黃酮化合物含量、C4H 和4CL 的活性及可溶性糖含量的影響很大，在較低溫度和土壤水分條件下，可溶性糖和酶活性（PAL、C4H 和4CL）的增加正向促進類黃酮的積累。同時BROSSA 等[18]研究了圣櫟在夏季和冬季時的類黃酮含量，建立了測定圣櫟葉中黃酮類化合物含量和相對豐度的高效液相色譜-質譜聯用方法，發現冬季圣櫟中的類黃酮成分顯著高于夏季，表明低溫更有助于類黃酮化合物的生成與積累，也得出了與前者相同的結論。YU 等[19]為探討光照和溫度對獼猴桃花青素積累的影響，在36 個與花青素相關的AccR2R3-MYB 轉錄因子中，AcMYB10 在紅肉獼猴桃果皮中表達量最高。AcMYB10 的表達與成熟過程中自然著色果實的花青素積累以及光/溫度誘導的愈傷組織著色高度相關。BHATIA 等[20]報道了低溫增強黃酮醇生物合成對光照的嚴格要求，通過基因敲除、過表達等研究發現，與野生型（WT）相比，在低溫環境下擬南芥HY5 和轉錄因子MYB11、MYB111、MYB12突變體與類黃酮生物合成相關基因的表達下降并且黃酮醇合成受到抑制，在HY5 突變體中過表達AtHY5 恢復了在低溫下黃酮醇的合成，AtMYB12 的過表達有利于低溫和光照條件下黃酮醇的積累。總之，低溫誘導黃酮醇合成需要HY5 和黃酮醇特異性MYB 調控因子的幫助。WANG 等[21]發現參與原花青素合成的MYB 轉錄因子可分為TT2 型和PA1 型,并從紅肉蘋果中鑒定了一個PA1 型MYB 轉錄因子MdMYBPA1，通過在蘋果愈傷組織中過表達和敲除表達該轉錄因子的方式鑒定了其在類黃酮合成中的作用，還探索了TT2 和PA1 型MYB 轉錄因子之間的關系，發現MdMYB9/11/12 可以結合MdMYBPA1啟動子。此外，MdMYBPA1 通過正向調控類黃酮的生物合成途徑過程中原花青素生成花青素的過程來響應低溫。在結合分析中，MdbHLH33 直接結合MdMYBPA1 啟動子的低溫響應（LTR）順式元件并促進其表達。此外，表達MdMYBPA1 和MdbHLH33的愈傷組織在低溫下形成復合物，誘導產生更多花青素。常麗等[22]研究發現低溫能增強C4H 酶的活性，同一土壤含水量條件下，低溫環境比高溫條件下更加促進了槲皮素、山柰酚、異鼠李素的合成，表明低溫（15 ℃）更有利于銀杏葉類黃酮化合物的生成和積累，而高溫（35 ℃）對銀杏葉類黃酮化合物的生成起到抑制作用。

2.1.3 水分 水分作為構成植物的必要成分，是其賴以生存的必不可少的因子之一。大部分研究表明，適度干旱、土壤含水量偏低反而會促進植物類黃酮化合物的合成。類黃酮的抗氧化性在植物抗旱脅迫適應中發揮了重要作用，已經有許多研究表明干旱脅迫過程中植物體內類黃酮成分含量顯著增加，適度的水分干旱有利于類黃酮化合物的積累[4,23]。CUI 等[24]采用高效液相色譜法（HPLC）測定葡萄花青素的種類和含量，并應用逆轉錄定量聚合酶鏈式反應（qRTPCR）分析花青素合成相關酶基因的表達，通過提高基因UFGT（類黃酮-3-O-葡萄糖基轉移酶）和MYBA1 的表達水平，研究了干旱脅迫和病毒GLRaV3侵染對花青素積累的影響，通過方差分析和相關性分析發現GLRaV3 侵染是增加花青素積累的決定因素,而干旱脅迫可以進一步增強感染GLRaV3 的葡萄葉片中花青素的積累。LI 等[25]研究發現UGT79B2和UGT79B3 的過表達顯著增強了植物對低溫和干旱、鹽脅迫的耐受性，而RNAi（RNA 干擾）和CRISPRCas9 產生的UGT79B2/B3 雙突變體更容易受到不利條件的影響。另外還鑒定了UGT79B2/B3 在添加原花青素UDP-鼠李糖苷和3-O-葡萄糖苷時的酶活性，UGT79B2/B3 的過表達顯著增加了花青素的積累，增強了抗氧化活性，而UGT79B2/B3 雙突變體花青素水平降低。當UGT79B2/B3 在不能合成花青素的突變體tt18 上過度表達時，這兩個基因都不能提高植物對逆境的適應能力，表明UGT79B2 和UGT79B3 通過調節花青素的積累賦予非生物脅迫耐性。謝岳等[26]對葡萄施以不同程度的水分脅迫，通過HPLC 測定葡萄果皮中花色苷含量以及結合qRT-PCR 實驗發現適度的水分脅迫上調花色苷合成相關結構基因PAL、CHS1、DFR（二氫黃酮醇還原酶基因）、F3′H、F3′5′H、UFGT 和轉錄因子MYBA1的表達，從而提高類黃酮化合物的積累，而過度的干旱則會抑制其含量的積累，這一結論也驗證了適度的水分對類黃酮物質的合成起到正向調控作用。

2.1.4 UV 輻射 類黃酮化合物的生物合成和積累在植物發育和環境中受到控制，UV-B 輻射是一種類黃酮合成的外界調控因素。適當劑量的UV-B 輻射作為啟動子對類黃酮化合物的積累是很重要的，高劑量反而會抑制類黃酮化合物的合成[7]。莫運才等[27]為探討環境中太陽紫外線（UV-B）輻射對鐵皮石斛幼苗生理代謝的影響，對鐵皮石斛分別進行5.1 μW/cm2和15.6 μW/cm2強度的UV-B 輻射實驗，結果發現在UV-B 輻射處理期間，5.1 μW/cm2輻射的類胡蘿卜素含量、類黃酮含量和 PAL 酶活性均高于對照組（未經輻射處理）；而15.6 μW/cm2的UV-B 輻射的類胡蘿卜素含量、類黃酮含量和PAL 酶活性在第8 d達最大值后迅速降低，表明高強度UV-B 輻射下鐵皮石斛可以合成較多的類黃酮，UV-B 輻射的增強誘導苯丙氨酸解氨酶活性增強，苯丙氨酸解氨酶作為植物類黃酮合成代謝的起始酶，促進了類黃酮的合成。HENRY-KIRK 等[28]為了了解紫外線對類黃酮化合物合成的影響，將蘋果在光譜濾光器下生長，濾光器可以改變太陽紫外線的透射率。果實分析表明，在一個季節的發育過程中，紫外線誘導了生理、代謝和基因表達水平的變化。花青素調節因子MYB10 激活MYB22 的啟動子，MYB22 的存在增強了HY5 激活FLS 啟動子的過程，從而誘導類黃酮化合物的生成，而降低紫外照射的強度會下調FLS、HY5、MYB10 和MYB22 這些調節因子的轉錄水平，從而降低花青素和黃酮醇的積累。YANG 等[29]分析了采前UV-B/-C 輻射和采后UV-A/-B/-C 輻射對藍莓發育過程中黃酮醇、原花青素和花青素的基因表達和代謝譜，發現采前和采后紫外光照射均顯著增加了果實發育早期黃酮醇積累量和果實發育后期花青素和原花青素含量，基因表達的變化與紫外照射后黃酮含量的變化平行，VcMYBPA1 轉錄因子在采前和采后紫外線照射下與VcLAR（無色花青素還原酶）和VcANR（無色花青素合成酶）密切相關，因此猜測該轉錄因子可能與花青素的生物合成有關。

2.1.5 激素 類黃酮的生物合成受激素的調控，采用外源激素可用于調控植物類黃酮的生物合成[4]。近年來，關于激素調控類黃酮代謝途徑的研究已成為熱點。沈欣杰[30]對轉色期前櫻桃外源施用脫落酸（ABA）,使用超高效液相色譜對花色苷含量進行測定，發現ABA 處理相對于對照組可以顯著促進櫻桃果實花色苷的合成，ABA 生物合成抑制劑NDGA 處理則顯著抑制了果實花色苷的合成，除了花色苷物質積累方面，在分子水平上，ABA 處理的果實中六個花色苷合成路徑關鍵酶基因的表達水平顯著高于對照組。李棟棟[31]用不同濃度ABA 處理開花兩周后的草莓果實，并進行轉錄組測序分析發現外源ABA 處理能增強PAL、TAL、4CL、DFR（二氫黃酮醇還原酶）等與草莓中類黃酮化合物合成相關的酶的活性，進而誘導花青素合成積累。有研究認為MYB基因的表達是由許多植物激素誘導的，包括脂基激素茉莉酸酯（MeJA）。MeJA 是一種內源植物生長調節劑，可調控類黃酮化合物等次生代謝物的合成，劉生財等[32]為了解MeJA 對莧菜細胞中類黃酮合成的影響，以莧菜懸浮細胞為材料，結合qRT-PCR 技術，檢測不同濃度MeJA 和添加時間處理對類黃酮積累的影響，結果顯示，在懸浮細胞培養的第4 d 添加200 μmol/L 時類黃酮含量達到最大；與對照（MeJA 0 μmol/L）相比，不同濃度MeJA 處理下，PAL、F3H、CHI、CHS基因表達量均極顯著上調，與類黃酮含量具有正相關性。本研究表明MeJA 濃度和添加時間對莧菜懸浮細胞中類黃酮和類胡蘿卜合成起著重要調控作用。LI 等[33]將MeJA 加入到甘草細胞懸液中，通過RNA 測序技術分析來識別差異表達的基因，結果顯示MeJA 對MYB 轉錄因子GlMYB4和GlMYB88 具有顯著的誘導作用，亞細胞定位發現GlMYB4 和GlMYB88 蛋白定位于細胞核，通過表達分析發現GlMYB4 和GlMYB88 可以正向調節甘草細胞中黃酮類化合物的合成。GONZALEZ 等[34]為研究ABA 是否參與了酚類化合物的積累，特別是花青素苷的生物合成，以干旱脅迫下的智利漿果為研究對象，施用氟立酮（ABA 生物合成抑制劑），并在24、48 和72 h 的干旱脅迫條件下在幼苗和完全展開的葉片上施用ABA，收獲植株后，分別采集葉片，檢測生化狀態。觀察到，氟立酮處理顯著降低了受脅迫植物的ABA 濃度和總花青素濃度，使此濃度達到了對照組植物的水平。施用ABA 可恢復脅迫植株在48 h 內的ABA 水平和總花青素濃度。qRT-PCR 結果顯示，經氟立酮處理的植株葉片中，AcUFGT基因表達降低，而隨后施用ABA 則增加了AcUFGT的表達。綜上所述，ABA 參與調控干旱脅迫下花青素苷的生物合成。YANG 等[35]為了探索ABA 是否參與多酚生物合成，通過高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜，從葡萄提取物中鑒定出16 個多酚類物質，外源褪黑激素和ABA 處理均顯著促進了黃酮醇和黃烷醇各組分的生物合成，尤其是兒茶素在褪黑激素200 μmol/L 處理時幾乎增加了一倍，參與類黃酮生物合成的4CL、CHS、F3H、FLS（類黃酮醇合成酶）、UFGT等基因的表達也明顯上調。JIA 等[36]利用一種新建立的煙草病毒誘導草莓果實基因沉默技術，下調ABA 生物合成關鍵酶基因FaNCED1 的表達，導致草莓果實中ABA 含量顯著下降，果實著色明顯減少。另外在轉基因RNA 干擾（RNAi）果實中也觀察到類似的無色表型，病毒誘導的基因沉默下調了ABA 受體基因FaCHLH/ABAR的表達。更重要的是，外源ABA 可以恢復但不能逆轉基因FaCHLH下調引起的RNAi 果實的無色表型，此外還觀察到FaCHLH/ABAR基因的表達水平下調不僅改變了ABA 水平和糖含量，還改變了一組ABA 和糖響應基因，外源糖可以顯著促進果實成熟，同時刺激ABA 積累。這些數據表明ABA 是促進草莓成熟的信號分子，ABA 受體FaCHLH/ABAR是草莓成熟過程中響應ABA 的正調節因子，可以影響草莓類黃酮化合物的生物合成。

2.1.6 礦物質 土壤中的營養物質對植物生長以及次生代謝物的合成有重要作用，鉀含量降低會導致C4H 和PAL 酶的表達下調，降低許多中草藥中類黃酮化合物的含量，有研究學者認為這可能是由于缺鉀對類胡蘿卜素合成途徑的影響導致的[37]。LEA 等[38]通過將擬南芥種子置于不同含氮量的培養基上播種來研究氮對類黃酮化合物合成的影響，研究發現氮元素缺乏反而會增強MYB 及bHLH 轉錄因子的表達最終促進擬南芥類黃酮合成。同樣DONG 等[39]對龍井茶進行不同水平氮處理，使用超高效液相色譜串聯質譜和氣相色譜串聯質譜定量分析以及PCR 分析顯示，正常的氮水平通過基因調控和底物碳水化合物的積累促進了龍井茶黃酮醇糖苷的生物合成，而異常的氮尤其是過量的氮對類黃酮的合成有抑制作用。YU 等[40]為深入了解鈣誘導花青素積累的分子機制，在全株噴鈣后一周對葡萄皮進行轉錄組測序，鈣處理共影響了1894 個差異表達基因（DEGs），其中上調基因1266 個，下調基因628 個，此外還發現鈣觸發了大量與鈣轉運和信號轉導、花青素的生物合成和轉運調控以及植物激素的生物合成和信號轉導相關的DEGs。通過分析上調、下調的DEGs，明確了外源鈣可能通過以下四個途徑改善葡萄漿果顏色：鈣通過激活與花青素生物合成相關的轉錄因子促進花青素積累；鈣通過刺激鈣和UFGT 的相互作用促進花青素的積累；鈣調素可能調節與花青素相關的轉錄因子，進而刺激花青素生物合成途徑中的基因；鈣信號刺激茉莉酸和乙烯的生物合成，通過增加內源糖含量或直接激活與花青素生物合成相關的轉錄因子，提高花青素含量。XU 等[41]為探討鈣處理對果實花色苷和酚類化合物含量的影響以及鈣處理對類黃酮合成途徑基因表達的影響，用不同濃度（10、20、50 mmol/L）的CaCl2溶液噴灑整個植株，比較了紅果和黃果兩種草莓品種的總酚類物質和花色苷含量，以及花色苷結構基因在草莓果實和其它組織中的表達譜。通過高效液相色譜和qRT-PCR 等技術進行分析，發現鈣處理提高了紅果果實中黃酮3-羥化酶（F3H1）、二氫黃酮醇4-還原酶（DFR2）、花青素合成酶（ANS1）和UDP-葡萄糖基轉移酶（UGT1）等花青素關鍵結構基因的表達水平，使總酚和花青素含量提高了20%以上。JIA[42]等分析了缺磷脅迫下煙草植株營養生長期的生理和分子變化，qRT-PCR 分析顯示，在缺磷葉片中，參與黃酮醇生物合成的基因NtCHS、NtCHI、NtF3H、NtF30H和NtFLS的轉錄水平升高。相比之下，花青素生物合成的關鍵基因NtDFR的轉錄水平在磷缺乏狀態下沒有升高，結果表明，在磷缺乏的情況下，煙草植株會積累黃酮醇，而不是花青素，此外還檢測到NtDFR上游調控基因NtAN2 的轉錄上調，因此猜測缺乏磷的煙草葉片花青素合成失活的原因之一可能是NtAN2 需要其他轉錄因子的激活。周銹連[43]采用蛋白質組學分析方法比較了磷充足和磷缺乏培養基上生長了7 d 的擬南芥幼苗的蛋白質譜，利用液相色譜-二級質譜聯用（LC-MS-MS）法結合蛋白質組學定量分析差異表達蛋白，分析發現磷缺乏有利于增強花青素的積累。

2.2 基因（轉錄因子）對黃酮化合物合成的調控

植物類黃酮的生物合成途徑由一系列結構基因和調節基因協同完成[44]，其合成結構基因編碼催化合成途徑中的酶，這些關鍵結構酶包括PAL、C4H、CHS、CHI、F3H、DFR 等，并受轉錄因子MYB、bHLH、WD40 和NAC 以及其他轉錄因子的調控[45]，下面重點對這幾類轉錄因子在不同類型植物中的調控機制進行歸納總結[46]。

2.2.1 MYB 轉錄因子 MYB 轉錄因子對不同植物結構基因和類黃酮合成影響不同，MYB 蛋白在調控類黃酮生物合成途徑中起著關鍵作用[47]。ZHAI 等[48]在梨果實中克隆了3 個候選MYB 轉錄因子，分別為PbMYB10b、PbMYB9 和PbMYB3，并通過過表達和RNAi 瞬時檢測進行功能驗證，結果表明PbMYB10b 作為花青素通路和原花青素通路的激活劑，但其功能可被其他MYB 轉錄因子補充，闡明了在梨果實中類黃酮合成與MYB 轉錄因子表達模式的關系。PbMYB9 是原花青素、花青素和黃酮醇途徑的激活劑，其作用是梨果實類黃酮生物合成所必需的。PbMYB3 是PbMYB10 的潛在調節因子。同時，PbMYB3 的同源基因MdMYB3 過表達可以激活果實中CHS、CHI、UFGT、FLS幾個類黃酮途徑基因的表達[49]，因此認為這幾種MYB 轉錄因子可能是梨果中類黃酮生物合成的調控因子[48]。ANWAR等[50]從中國水仙中鑒定了一個R2R3 MYB 轉錄因子NtMYB2，并對其進行了功能表征。通過瞬時表達分析發現NtMYB2 轉錄因子參與了花青素生物合成途徑的調控，并可能通過下調中國水仙關鍵酶基因的轉錄來抑制花青素生物合成。ZHU 等[51]從菊花中分離出編碼R2R3-MYB 轉錄因子的CmMYB8基因并對其進行了功能表征，發現CmMYB8 是菊花R2R3-MYB 轉錄因子，對木質素和類黃酮化合物的合成起到負調控作用。LI 等[52]對鳶尾科單子葉開花植物小蒼蘭的R2R3-MYB 的基因FhMYB5 的功能進行了鑒定，相關分析表明，FhMYB5 基因的表達與小蒼蘭體內花青素和原花青素的積累具有很好的一致性，FhMYB5 單獨作用時，輕微上調晚期類黃酮合成基因DFR和無色花色素雙加氧酶基因（LDOX），而當FhMYB5 與bHLH 轉錄因子基因FhTT8L和FhGL3L共同發揮作用時，早期和晚期類黃酮合成基因均被明顯激活，FhMYB5 在煙草和擬南芥中的過表達也可明顯上調參與總黃酮途徑的基因表達，表明FhMYB5 在小蒼蘭總類黃酮途徑中發揮調控作用。TIAN 等[53]對協同調控原花青素和花青素生物合成的海棠的兩種R2R3-MYB 轉錄因子McMYB12a 和McMYB12b 進行了功能表征，結果發現McMYB12a 主要通過與花青素生物合成基因啟動子的結合來上調花青素生物合成基因的表達，而對原花青素生物合成基因的調控作用僅為次要，而McMYB12b 則優先結合原花青素生物合成基因的啟動子。煙草中過表達McMYB12a 和McMYB12b改變了類黃酮生物合成基因的表達，促進了煙草花瓣中原花青素和花青素的積累，而利用保守的基因區域瞬時沉默會導致原花青素和花青素產量減少。同時，這兩個基因在海棠果實中過表達和煙草中過表達具有相似的作用，在海棠中沉默McMYB12 轉錄因子與在煙草中沉默該轉錄因子也具有相似的作用，揭示了海棠葉片依賴于McMYB12a 和McMYB12b 表達的自調節平衡來調控花青素積累。

2.2.2 bHLH 轉錄因子 bHLH 轉錄因子是轉錄因子最大的家族之一，在類黃酮化合物等多種次生代謝產物的調控中發揮著重要作用。ZHAO 等[54]在羊草中發現了bHLH 型轉錄因子LcbHLH92，在擬南芥中表達該轉錄因子發現其表達水平與種子顏色、花青素合成酶（ANS）和花青素還原酶（ANR）轉錄水平呈負相關，過表達LcbHLH92 會導致葉片和種子中花青素和原花青素的積累減少。ZHAO 等[55]克隆并鑒定了bHLH 家族蛋白PabHHL1 的功能，PabHLH1與參與類黃酮生物合成的IIIf 亞家族bHLH 轉錄因子相關，瞬時表達實驗表明，PabHLH1 存在于細胞核和細胞質中，酵母單雜交實驗表明其具有交互活性，當PabHLH1 在附子草中表達時，雙芐基和黃酮類化合物的含量與這些化合物生物合成途徑中相應基因的轉錄水平呈正相關，當PabHLH1 在擬南芥中異源表達時，激活了黃酮類化合物和花青素的合成，參與了黃酮類化合物合成早期和晚期結構基因的上調。在矢車菊中，DENG 等[56]篩選出4 個R2R3-CcMYB轉錄因子分類為4 或6 亞群，1 個CcbHLH1 轉錄因子分類為IIIf 亞群，進一步分離出黃酮3-羥化酶（CcF3H）和二氫黃酮醇4-還原酶（CcDFR）啟動子，發現CcMYB6-1 顯著上調上述兩個啟動子的活性，刺激花青素積累，與CcbHLH1 共同浸染后，其活性明顯增強。此外，酵母雙雜交和雙分子熒光互補試驗均顯示了這兩種激活劑之間的相互作用，因此表明轉錄因子CcMYB6-1 和CcbHLH1 分別是R2R3MYB和IIIfbHLH 的同源物，它們協同參與調控花青素的生物合成。葡萄中，WANG 等[57]化學合成了密碼子優化的葡萄VvbHLH1 基因，VvbHLH1 的過表達上調了參與類黃酮合成、ABA 信號通路、脯氨酸合成和活性氧清除系統的基因，因此認為葡萄bHLH 轉錄因子基因VvbHLH1 可能被用于增加類黃酮化合物含量以及提高類黃酮和其他植物對非生物脅迫的耐受性。在蘋果花青素代謝的分子機制研究中，XU 等[58]利用酵母雙雜交、蛋白質體外結合和雙分子熒光互補試驗表明，MdMYB16 與MdbHLH33 形成同源二聚體并相互作用，而LBSMdMYB16 不與MdbHLH33 相互作用，在過表達MdMYB16 的愈傷組織中過表達 MdbHLH33， 發現它減弱了MdMYB16 對花青素合成的抑制作用，這些結果表明MdMYB16 和MdbHLH33 可能是控制花青素合成途徑的重要調控網絡的一部分。

2.2.3 WD40 轉錄因子 WD40 是一個基因家族，編碼一類WD40 蛋白，該蛋白是植物體內調節類黃酮的三大轉錄因子之一，它主要通過結構域與其他蛋白發生互作，以此來行使它的調控功能[59]。WD40 蛋白又稱WD40 結構域蛋白，是真核生物中的一個大基因家族。LIU 等[60]鑒定了178 個馬鈴薯WD40（StWD40）基因，并對其染色體分布、基因結構和保守基元進行了評估。結果發現，與一種WD40 蛋白TTG1 相互作用的蛋白有112 對，其中27 對在色素組織中差異表達，表明馬鈴薯WD40 蛋白可能與花青素的生物合成和非生物脅迫反應有關。此外，有研究表明蘋果花青素和原花青素的積累受到MYB、bHLH 和WD40 蛋白這三類調節因子的嚴格調控。AN 等[61]鑒定了一種促進花青素積累的蘋果WD40蛋白（MdTTG1），當MdTTG1 基因在擬南芥中過度表達時，類黃酮途徑下游所需的生物合成基因上調，酵母雙雜交實驗和雙分子熒光互補試驗表明，蘋果MdTTG1 基因通過與bHLH 蛋白相互作用調節花青素的合成與積累。

2.2.4 其它 NAC 轉錄因子家族是植物類特有的一種轉錄因子超家族，該轉錄因子由一個保守的N 端結構域和高度可變的C 端轉錄激活域組成，NAC 轉錄因子在植物生長發育過程中起著重要作用[62]。SUN 等[63]鑒定了一種NAC 轉錄因子MdNAC52，其基因轉錄水平在蘋果著色過程中升高，蘋果愈傷組織MdNAC52 過表達積累了花青素。通過酵母單雜交、電泳遷移、染色質免疫沉淀和熒光素酶報告基因檢測表明，MdNAC52 可與MdMYB9 和MdMYB11的啟動子相互作用，參與花青素合成的調控。MdNAC52 還可與LAR 啟動子結合，調控其表達，促進花青素合成。這些發現證實了MdNAC52 結合MdMYB9 和MdMYB11 的啟動子促進花青素的生物合成。JIANG 等[64]在荔枝果實中，通過電泳遷移和瞬時表達分析發現LcNAC13 轉錄因子直接與花青素生物合成相關基因（LcCHS1/2、LcCHI、LcF3H、LcF3H、LcDFR、LcMYB1）啟動子結合，抑制其轉錄，而LcR1MYB1 與LcNAC13 發生物理作用，逆轉LcNAC13 的負作用，因此推測LcNAC13 和LcR1MYB1 可能在荔枝果實成熟過程中協同調控花青素生物合成，這為花青素生物合成調控網絡的研究提供了新的思路。另外還有HD-Zip I 轉錄因子，此前研究表明HD-Zip I 亞家族基因參與了環境脅迫反應、果實成熟等，但對其在花青素積累中的作用研究較少。HD-Zip 蛋白由同源框結構域（HD）和同源框結構域相關亮氨酸拉鏈（Zip）組成，JIANG 等[64]報道了HD-Zip I 轉錄因子MdHB1 也參與了花青素積累的調控。MdHB1 沉默導致蘋果果肉中花青素的積累，而其過表達降低了紅肉蘋果果肉中花青素的含量。此外，過表達MdHB1 的轉基因煙草花的著色明顯減少，瞬時啟動子激活試驗和酵母單雜交結果表明，MdHB1 間接抑制花青素生物合成基因DFR和UFGT的表達。酵母雙雜交和雙分子熒光互補證實MdHB1 能與細胞質中的MYB、bHLH 和WD40 相互作用，分析表明MdHB1 可以抑制MdMYB10、MdbHLH3、MdTTG1 進入細胞質，進而間接抑制MdDFR、MdUFGT 的轉錄。當MdHB1 被沉默時，這些轉錄因子被釋放，激活MdDFR 和MdUFGT 的表達和花青素的生物合成[65]。另外還有一種鋅指轉錄因子，通過調控下游基因的表達在植株應答非生物逆境的過程中扮演重要角色。SHI 等[66]發現擬南芥鋅指轉錄因子（ZAT6）水平被H2O2誘導激活，調節AtZAT6 的表達對花青素和總黃酮的濃度均有正向影響。AtZAT6 通過與CHI、F3H、DFR、MYB12 和MYB111 基因的啟動子結合，直接激活了這些基因的表達，MYB12 和MYB111 的激活上調了CHS和F3H酶基因的表達，表明AtZAT6 通過直接與幾個參與花青素合成的基因啟動子結合，在H2O2激活的花青素合成中發揮重要作用。

3 結論

類黃酮化合物作為植物中廣泛分布的一種次級代謝產物，對植物的生長發育具有重要意義。越來越多的研究表明，類黃酮化合物對人類健康有重要意義。隨著分子生物學技術的發展，類黃酮化合物的合成途徑和調控機制已逐步闡明，不論是外界環境因素還是生物因子的研究都已逐步深入，本文綜述了近年來對類黃酮化合物生物合成途徑的調控，包括外界環境因素和生物因子兩方面的研究成果。近年來，基因組信息和各種組學技術的發展為我們的深入研究提供了工具，由于類黃酮化合物的各種功能對人體健康的益處，在實際生活中有很重要的現實意義。目前的研究水平大多是通過調控積累產物的量和在基因水平對相關轉錄因子進行過表達或抑制，通過基因或酶表達水平上調或下調來觀察產物的量，而與類黃酮合成相關的酶基因和啟動子的結構與功能、調控基因的作用機理還有環境條件對植物蛋白質組差異表達的影響、基因轉錄組數據分析以及類黃酮化合物分解代謝等方向還有待于進一步研究，以期為植物類黃酮化合物的開發和利用提供更具體深入的理論依據[4,47]。