COPD 患者血清Rho激酶水平測定的臨床意義*

黃鶴，張念志

安徽省中醫院 安徽合肥 230031

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）簡稱慢阻肺，是一種可以預防和治療的慢性氣道炎癥性疾病，氣流受限不完全可逆為其主要特征。慢阻肺臨床癥狀呈進行性加重，以胸悶、氣喘，呼吸困難為主要表現。相關資料結果顯示COPD發病率有顯著地區差異。我國農村地區人群中COPD的男性患病率明顯高于女性，部分欠發達地區患病率高達9.88%，給社會和家庭帶來了巨大的經濟和社會負擔[1]。

慢阻肺的炎癥反應主要累及肺部及氣道。反復肺部感染，氣道炎細胞浸潤，導致黏液高分泌，形成氣道的反復損傷和修復，最終導致氣道重塑[2]。氣道阻塞和結構重塑會導致通氣功能障礙，造成機體慢性缺氧，引起相應的病理生理學改變。肺血管在長期缺氧或伴有CO2潴留條件下收縮明顯增強，血管內皮細胞的增殖凋亡均發生障礙，最終導致COPD相關性肺動脈高壓的產生。

ROCK1是廣泛存在于人體組織中RhoA/Rho 激酶信號通路上的一個重要信號分子。近年來相關學者已經認識到慢阻肺相關性肺動脈高壓與RhoA/Rho激酶信號通路密切相關[3-4]。因此本實驗測定不同人群外周血清ROCK1水平及其肺動脈收縮壓，并探究兩者之間的相關性。

資料與方法

1 入組標準

1.1 診斷標準

1.1.1 COPD診斷標準 參照《2019慢性阻塞性肺疾病全球倡議》，具有相應癥狀、體征及影像學特征的對象均在我院肺功能室行肺功能測定，檢查前一天均未使用任何支氣管擴張劑及糖皮質激素。吸入支氣管擴張劑沙丁胺醇后，肺功能測定顯示 FEV1/FVC<70%才可診斷。

1.1.2 肺動脈高壓診斷標準 參照2018年中國肺高血壓（Pulmonary hypertension PH）診斷和治療指南，靜息狀態下右心導管所測肺動脈平均壓（mPAP）≥25mm Hg即可作出診斷。目前認為mPAP=0.61×肺動脈收縮壓（PASP）+2 mmHg，因此PASP≥40mm Hg 即可診斷為 PH[5]。本實驗采用心臟彩超所估測肺動脈收縮壓值作為診斷標準。

1.2 納入標準 參照入組標準，入選45例分為3組，每組15例。A組為健康體檢者不伴有肺動脈高壓 ，B、C兩組均為我科住院治療符合COPD診斷標準的患者，且 C組患者還符合心臟彩超診斷為肺動脈高壓的標準。

1.3 排除標準 ①除外近期使用過他汀類藥物[6]；②除外合并其他嚴重疾病如肝腎功能不全、腫瘤等疾??；③除外其他類疾病所致肺動脈高壓，如結締組織疾病、先天性心臟病、心臟瓣膜病、左心疾病、胸廓畸形、肺血栓栓塞、睡眠呼吸障礙等疾病引起的肺高壓。

2 一般資料

選取同一時期在安徽省中醫院呼吸內科住院治療或體檢中心體檢健康者共45例。參照入組標準，入選45例分為3組。A組15例為健康體檢者不伴有肺動脈高壓，B組15例為單純COPD患者，C組15例為COPD并發肺動脈高壓患者。

3 檢測方法

3.1 主要試劑與儀器 彩色多普勒超聲心動圖儀；肺功能儀（德國耶格）；RT-6000酶標儀（雷杜）；JW3021HR離心機（安徽嘉文）；DNP-9052BS-Ⅲ電熱恒溫箱（上海三發）；漩渦混合器；ROCK1 ELISA試劑盒（北京安迪華泰生物）。

3.2 肺功能檢查 采用我院現有德國耶格肺功能儀測定靜息狀態下吸入支氣管擴張劑沙丁胺醇后一秒用力呼氣容積占用力肺活量的比值（FEV1/FVC%）。

3.3 PASP測定 所有45例入組者均經我院心臟超聲測定其三尖瓣最大返流速度（V）。將經檢測所得三尖瓣最大返流速度（V）代入簡化的柏努利方程，即P=4V2，PASP=4V2＋右房壓。右房壓力值一般為5～10mmHg之間，最終計算得到估算的PASP值。目前臨床和相關研究證據均表明，心臟彩超估測肺高壓與右心導管檢測方式相比，不僅無創、檢測方便且檢查結果準確性高[7]。

3.4 血清標本的采集 收集45例入組對象空腹靜脈血，將其經過3000r/min離心20min。抽取離心后的上清液1mL用于ROCK1的測定。

3.5 血清ROCK1的測定 ①標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔10孔，先在第1、2孔中分別加標準品100μL，再向其中加稀釋液50μL混勻；然后從第1、2孔中各取100μL加入第3、4孔，再在第3、4孔分別加稀釋液50μL混勻；然后從3、4孔中各取100μL，其中50μL棄之，剩余50μL分別加到第5、6孔中，再在第5、6六孔中加稀釋液50μL混勻；后孔依法同前，最終各孔稀釋后加樣量均為50μL，濃度分別為 180 pmol/L，120 pmol/L，60 pmol/L，30 pmol/L，15 pmol/L。②加樣：在酶標包被板上分設待測樣品孔和空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）。先將10μL待測樣品加入待測樣品孔中，然后加入稀釋液，稀釋度為5倍，再將稀釋樣品加于酶標板孔底部混勻。溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30min。配液：將濃縮洗滌液稀釋30倍后備用。洗滌：溫育后每孔棄去液體，甩干，用洗滌液再反復的洗板5次，拍干。加酶：每孔加入酶標試劑50μL，空白孔除外。再次溫育、洗滌。③顯色和終止：充分洗滌后，每孔加入TMB混合均勻后避光顯色15min，當其變成藍色后向每孔加終止液，顏色由藍變黃表示反應終止。

④測定和計算：加入終止液后立即以酶標儀測定各孔的吸光度（OD值），15min內完成所有孔的測定，最后將各OD值代入方程式，計算得出數值。

4 統計學方法

采用SPSS21.0統計軟件進行數據分析。3組性別構成比采用卡方檢驗。各組實驗數據均為計量資料，以均數±標準差（）對各組數據進行統計描述。各指標均進行正態性和方差齊性檢驗，符合正態分布和方差齊性一致情況下，多組間均數比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK檢驗，兩個隨機變量的相關關系采用Pearson直線相關分析。

結 果

1 3組研究對象血清ROCK1表達水平的比較

各組研究對象之間的年齡和性別組成無統計學差異（P>0.05），COPD 組肺動脈收縮壓與正常對照組相比，差異無統計學意義（P>0.05）。COPD 并發 PH組分別與另兩組相比，肺動脈收縮壓顯著升高且具有統計學差異（P<0.05）。COPD 組血清ROCK1與正常對照組相比，差異無統計學意義（P>0.05），COPD 并發PH 組分別與另兩組相比，血清ROCK1顯著升高且具有統計學差異（P<0.05）。見表1。

表1 3組研究對象一般資料及血清ROCK1表達水平比較

2 3組研究對象血清ROCK1表達與PASP的相關性分析

3組研究對象中血清ROCK1水平與肺動脈收縮壓呈正相關（r=0.637，P<0.05），見圖 1。

圖1 血清ROCK1水平與PASP的相關性分析

討 論

隨著慢性阻塞性肺疾病的進行性進展，缺氧等因素使肺循環血管阻力不斷增高，右心室負荷不斷增加，進而導致肺源性心臟病。肺心病已成為COPD患者三大并發癥之一，是COPD患者住院和病死的主要原因。

Rho/Rho 激酶信號通路廣泛存在于人體肺組織中，參與了肺部多種疾病的發生與發展，屬于多種肺部疾病如肺動脈高壓、哮喘等疾病的重要研究對象。Rho蛋白又被稱為Rho GTP酶，其具有GTP酶活性，有 RhoA，RhoB，RhoC 三種異構體，為信號通路上游的主要分子。Rho蛋白在上游通過與GTP或GDP之間結合的相互轉換來激活或失活信號通路中的下游分子Rho 激酶，進而引起下游底物產生一系列生物學效應。Rho激酶（Rho-associated kinase）又稱ROCK，屬蘇氨酸／絲氨酸蛋白激酶家族一員，其有ROCK1（ROKβ，p160-ROCK）和ROCK2 （ROKα）兩個亞型[8]。ROCK1和ROCK2亞型在體內有不同的器官分布與表達，ROCK1主要在肺臟、肝臟及骨骼肌中分布表達，而ROCK2在腦、與肌肉中表達更高[9]。ROCK分子質量大約160 kD，其氨基酸序列由 N端的催化結構域、盤旋螺旋域，PH結構域成，其中盤旋螺旋域中含Rho結合域[10]。

目前已經知道肌球蛋白輕鏈磷酸酶（MLCP）、肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）決定著肌球蛋白輕鏈（MLC）磷酸化的水平，而肌球蛋白輕鏈（MLC）磷酸化水平的高低又是決定肺血管收縮的關鍵因素，與肺動脈高壓的產生密切相關[11]。Rho/Rho 激酶信號通路通過活化的Rho激酶，進而通過其鈣敏感性調節這一途徑調節MLC磷酸化水平。活化的Rho激酶既可直接使MLC上兩個氨基酸位點發生磷酸化；同時Rho激酶與其在肌球蛋白輕鏈磷酸酶的靶亞基 1 （MYPT1）上的Thr850相結合，使其磷酸化，導致 MLCP失活，失活的MLCP不能使磷酸化的MLC脫磷酸化，間接提升了細胞漿內MLC磷酸化水平，增加肌動－肌球蛋白交聯而促進肌絲收縮。

本研究分別選取經心臟超聲測定的肺動脈收縮壓和人血清Rho激酶作為觀察指標，PASP值的大小可直接反映著肺血管壓力的高低，后者其值高低反映Rho/Rho 激酶信號通路的激活。本實驗結果表明慢阻肺并發肺高血壓患者血清Rho激酶表達較單純慢阻肺患者及正常人明顯升高，且PASP值與其ROCK1水平呈正相關性。慢阻肺患者肺高血壓的發生發展可能與Rho/Rho 激酶信號通路激活密切相關。但本臨床實驗入組總樣本量偏少，且未檢測Rho激酶信號通路中上下游信號分子，今后在臨床上能否通過檢測慢阻肺患者血清ROCK1來評估肺動脈高壓的嚴重程度仍需大樣本、多中心研究數據提供更多證據。