透明質酸生產工藝

1986年 雞冠提取

公雞冠透明質酸的制備及其理化性質 沈渤紅 張天民

摘要：選用我國尚未開發的動物資源公雞冠為原料，設計了適于生產的制備工藝，并對所得產品進行了理化分析，為透明質酸制劑的生產提供了實驗依據。

結論：為了保持透明質酸的大分子特性，采用了一次蛋白酶解、Sevag技術與CPC分級沉淀技術配合使用，有效地除去了蛋白質和核酸。實驗中發現：在高鹽濃度下，大部分蛋白質遇到有機溶劑可變性，或被鹽析沉出，或在乙醇沉淀之后不再溶于水，這一步可明顯地使提取液得到純化。根據多糖與蛋白質的CPC復合物解離臨界鹽濃度不同的這一原理，我們進一步采用CPC分級沉淀，以除去剩余蛋白質與核酸。

實驗中觀察到，乙醇沉淀透明質酸水提液時，出現兩種形式的沉淀，主要部分為纖維狀，漂浮于上部，另一部分為粉末狀，沉于下部。當在強酸條件下，用氯仿處理提取液后，再沉淀時，纖維狀沉淀消失，溶液黏度明顯降低，說明纖維狀沉淀與大分子特性和溶液濃度有關。透明質酸溶液濃度在低于0.05%時，其分子在溶液中大多獨立存在;當濃度大于0.1%時，部分交織成網狀結構。推測這種網狀結構物質沉淀下來呈現纖維狀，而部分散的分子沉淀下來呈粉末狀。

從保持其高分子量、高黏度和高純度等方面進行了理化分析，結果表明：經換算，本工藝制備的雞冠透明質酸的分子量接近Healon（眼用黏彈劑），并具有高黏度及高純度特性，可用于配制透明質酸制劑。

文獻來源：沈渤紅，張天民.公雞冠透明質酸的制備及其理化性質[J].醫藥工業，1986，17（7）：291-294.

1986年 動物眼玻璃體提取

牛眼玻璃體透明質酸的研制及應用 凌沛學 張天民 張子剛

摘要：從牛眼玻璃體制備了透明質酸，所得樣品的理化分析結果表明其質量達到眼科用的要求，動物實驗及眼科臨床試用后認為其制劑可用于眼科臨床。

結論：由于眼科用HA制劑要求具有高黏度，本工藝盡量采用溫和條件，避免可能使HA降解的處理，并且使雜質含量低于國外產品。用乙醇沉淀HA時，可得到絮狀和粉狀兩種沉淀，將粉狀HA用水溶解，再用丙酮沉淀，可變成絮狀，說明兩者在結構及分子量上并無顯著差異。制劑制備工藝中選用26%甘油等滲液作溶劑，既可增加制劑黏度，又可提高其穩定性。

動物眼科實驗各項觀察結果表明，HA所致眼組織反應均略低于對照組，證明所得制劑無抗原性及致炎性，眼組織可很好地耐受。眼科臨床試驗表明，牛眼HA制劑可加深前房，維持前房一定深度，便于手術操作，保護角膜內皮細胞，防止虹、角膜黏連，提高手術成功率。

文獻來源：凌沛學，張天民，張子剛.牛眼玻璃體透明質酸的研制及應用[J].醫藥工業，1987：18（7）：295-299

2005年 人臍帶提取

從人臍帶殘留物中分離、純化和表征透明質酸

Guillermo Lagoa， Loida Orunab， Jose A.Crematac， Carlos Perezd，Gabriel Cotoa， Efren Lauzana，John F.Kennedye

摘要：本文的主要目的是討論分離透明質酸的新程序。透明質酸可以從人臍帶殘留中獲得，從其他生物制藥生產中獲得。該路線涉及用氯化鈉溶液處理人臍帶殘留物，然后用季銨鹽溶液沉淀;將固體重新懸浮在氯化鈣溶液中以解離透明質酸季銨鹽復合物，然后乙醇誘導沉淀得到產物。產物經氯仿抽提4次純化，并用化學方法如Blumenkrantz和Asboe-Hansen糖醛酸測定法、Elson Morgan己糖胺定性試驗、特性黏度、離子交換色譜法、13C核磁共振譜等表征。結果表明，該產品可用于配制治療皮膚病的軟膏、乳液和乳膏。

結論：本文描述了一種從用有機溶劑處理過的人臍帶產生的副產品中分離HA鈉鹽的來源，迄今為止從未報道過。與其他已知方法相比，所采用的程序更簡單，并具有多個優點。例如，開發Balazs方法（1979）需要許多步驟。在Balazs方法的第一階段，原材料用水洗滌，直到從組織中去除血液，然后壓碎并儲存。在第二階段，組織用20倍體積的水和1倍體積的氯仿處理，攪拌24小時并過濾以提取HA和其他多糖。在我們的方法中，不需要第一個Balazs階段，因為使用了其他生產中剩余的原材料，并且使用0.2%w/v氯化鈉水溶液作為HA提取的主要溶劑。這種濃度的氯化鈉溶液在萃取極性化合物（包括HA）時更有效。

這種方法也可以與Danishevsky和Bella（1966）的方法進行比較，因為同樣使用0.2%氯化鈉溶液作為從原料中提取HA的溶劑，但在我們的案例中，人類臍帶殘留物被用作生物來源和0.9 M氯化鈣溶液，僅用于解離HA-CTAB復合物。這些方面以前沒有報道過。

文獻來源：Guillermo Lago，Loida Oruna，Jose A.Cremata，Carlos Perez，Gabriel Coto，Efren Lauzan，John F.Kennedy.Isolation，purification and characterization of hyaluronan fromhuman umbilical cord residues[J].Carbohydrate Polymers，2005.62：321-326.

2006年發酵法生產

發酵法生產透明質酸 張玉 張朝中

摘要：透明質酸（hyaluronic acid，HA），又名玻璃酸，是一種酸性黏多糖。1934年美國Meyer等首先從牛眼玻璃體中分離出該物質。此后，人們利用現代發酵技術和設備，以提高HA產率為目的，對發酵生產HA進行了較全面地研究。

HA發酵的一般工藝流程：[培養]→[移種]→[醇沉]→[溶解]→[絡合沉淀]→[醇沉]→[脫水干燥]

結論：發酵法生產的HA在菌體外的溶液中游離存在，與從動物組織提取相比，無需提取步驟，易于分離純化。HA的發酵水平從2～4g/L，提高到6～7g/L，發酵法生產HA比提取法有較大優勢。

目前所用的菌種是經過誘變處理鏈球菌，其的營養物質目前所用的氮源為各種肉浸膏、蛋白胨、氨基酸、酵母膏等，其中酵母膏最常用。在發酵液中添加一定量的谷氨酸和精氨酸，可以提高HA的產率。碳源主要是各種單糖、蔗糖和淀粉水解物，最常用的是葡萄糖。其它還有磷酸鹽、硫酸鹽，鉀、鈉等無機鹽，鐵、錳等微量元素。

HA的發酵有需氧發酵也有厭氧發酵。目前看來，多傾向于有氧發酵，專利文獻中HA產率較高的多采用通氣需氧發酵，而且分子量高。厭氧發酵產率低，分子量也低。在整個發酵過程中通常保持一個適當的溶氧量，而在不同的階段采用不同的溶氧量，也是提高HA產率的手段之一。

在HA的發酵生產中，pH值是一個重要的因素，一股控制在6.0～8.5范圍內，低于6.0或高于8.5，會影響菌體的生長，降低HA的產率和分子量。在發酵過程中，需要用氫氧化鈉或碳酸鈉溶液進行中和，以維持適當的DH值。

發酵生產HA具有產量不受原料資源限制、成本低、分離純化工藝簡捷、易于規模化生產等特點，是HA生產的發展方向，應進一步深入研究和提高。

文獻來源：張玉，張朝中發酵法生產透明質酸[J].北方藥學，2006，3（02）：10-11.