基于qPCR技術分析黃連對潰瘍性結腸炎小鼠腸道內嗜黏蛋白阿克曼氏菌的影響

楊光勇，涂小華，游豐鋒，何亞敏，喻良錦，田維毅，何光志*

(1.貴州中醫藥大學基礎醫學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州中醫藥大學第二臨床醫學院，貴州 貴陽 550025;3.貴州中醫藥大學第一臨床醫學院，貴州 貴陽 550025)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是腸道免疫穩態被打破而導致的腸道炎癥，病變主要限于結腸的黏膜，主要臨床表現為腹瀉、腹痛、黏液便及膿血便，會引起中毒性腸擴張、腸狹窄、腸穿孔、結腸癌等，這些癥狀嚴重影響患者正常生活和工作[1]。UC的病因與機制尚未明確，但腸道免疫紊亂是其發生發展的重要原因之一。腸道微生態系統是機體龐大、重要的微生態系統。腸道菌群按照對宿主的作用分為共生生理性細菌、共棲條件致病菌和病原菌，其中共生生理性細菌為專性厭氧菌,是腸道優勢菌群，占腸道菌群總量的99%，而98%的厭氧菌分布于盲腸與結腸[2]，嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila,A.muciniphila)就是其中之一。A.muciniphila的代謝產物丙酸對機體有明確的免疫調節作用，在糖尿病、肥胖癥、潰瘍性結腸炎、結腸癌等多種疾病中具有重要的作用[3]。

黃連清熱燥濕，瀉火解毒，是諸多治療潰瘍性結腸炎的方劑中的主要成分，黃連中的鹽酸小檗堿和黃連堿[4]等多種成分通過改善受損的腸黏膜屏障和調節腸道微生態，在治療潰瘍性結腸炎中起到較強的抗炎和免疫調節作用。前期研究發現黃連解毒湯對大鼠腸道內的A.muciniphila菌有促進作用[5]，為進一步研究黃連對其在UC小鼠中的影響，本研究通過與傳統藥物美沙拉嗪進行對比實驗，用實時定量PCR(quantitative Real-Time PCR, qPCR)對各組結果進行絕對定量分析，從腸道特定共生菌群A.muciniphila細菌的角度出發，探究黃連對該菌的作用在UC疾病中的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級6周齡KM小鼠40只，雌雄各半，體質量(20±2)g，購自長沙市天勤生物技術有限公司，動物使用許可證號：SCXK(湘)2019-0014。小鼠以小組單籠喂養，自由進食和飲水，環境：濕度60%、溫度25 ℃、12 h/12 h的光照/黑暗周期。所有實驗操作符合3R原則(減少、替代、優化)給予人道關懷。

1.2 實驗試劑與藥品

右旋葡聚糖硫酸鈉(dextran sulphate sodium，DSS，Sigma-Aldrich 公司，批號：H02J9B62777)；中草藥黃連(北京同仁堂)；美沙拉嗪(莎爾福公司，批號：17G27518L)；糞便基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN公司，批號：S8114)；2×RealStar Green Fast Mixture(GeneStar 公司,批號：9AG01)；96-Well PCR Plate HC96101-01，(GeneStar 公司,批號：9BC01)；PCR Sealing Film HC96551-01，(GeneStar公司,批號：9BB01)。

1.3 主要儀器

CFX96TM實時PCR檢測儀(BIO-RAD,美國)，核酸濃度檢測儀(Thermo Fisher Scientific,美國)。

1.4 實驗方法

1.4.1 藥物制備及給藥方法

按人與小鼠體表面積折算計算給藥劑量，配制成6.5 mg/mL的美沙拉嗪藥液，按0.1 mL/10 g體積對小鼠灌胃給藥，每天3次；從北京同仁堂購入黃連，制備水煎藥。參考李國輝[6-7]等實驗研究，為避免對小鼠產生抑菌效果和腦神經損傷，最終將給藥劑量定為0.3 g/kg。取3 g黃連，用100 mL去離子水泡20 min，水煎30 min左右，再補足去離子水至100 mL即為3×10-2g/mL濃度。給藥劑量0.3 g/kg即是3×10-3g/10 g，則一只體質量20 g的小鼠給藥量為6×10-3g，即按3×10-2g/mL劑量取0.2 mL，每天1次灌胃給藥。

1.4.2 實驗分組及UC模型制備

小鼠按隨機數字表法分為空白對照組，模型組，美沙拉嗪組(65 mg/kg)，黃連組(0.3g/kg)，每組10只?？瞻讓φ战M給予蒸餾水，參考李望[8]、吳昊[9]和胡仁偉[10]等探討總結的誘發小鼠較理想的UC模型的方法，用葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導制備UC小鼠模型，各組采用3% DSS溶液連續灌胃7 d，誘導UC模型，第8天開始全部換成蒸餾水。造模成功后第1天開始灌胃給藥，除空白對照組與模型組給予蒸餾水外，其余各組按上述劑量給予相應的藥物，連續給藥10 d。

1.4.3 引物設計與合成

根據秦倩倩[11]等的研究，合成A.muciniphila細菌基因特異性引物，上游引物：5′-CAGCACGTGAAGGTGGGGAC-3′，下游引物：5′-CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT-3′，基因全長：329 bp，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4.4 各組樣品基因組模板制備

DNA實驗第18天，收集小鼠新鮮糞便，用糞便基因組DNA試劑盒說明書嚴格進行操作，提取基因組DNA，用核酸濃度檢測儀測定提取的DNA模板的純度及濃度，確保DNA純度A260/A280比值在1.8左右，濃度在200 ng/μL左右，均置于-20 ℃保存備用。

1.4.5 qPCR標準品目的DNA的制備

用空白對照組DNA進行PCR擴增，并將擴增產物提取后送上海生物工程有限公司合成進行克隆測序，測序結果顯示與Gene-Bank公布序列(NR_042817.1)一致，抽提克隆菌質粒保證其質量在4 μg以上。選用在20 μL體系終濃度0.5 ng/μL的標準品目的DNA的拷貝數為：copies/μL=(9.12×1011)×(0.5 ng/μL)/(1 865+329 bp)≈2.0×108copies/μL。

1.4.6 qPCR反應體系和擴增條件

參考秦倩倩[11]等研究的方法用標準品目的基因質粒進行實驗和調整。取上述20 μL體系終濃度0.5 ng/μL的克隆基因質粒再稀釋10倍作為模板。反應采用20 μL體系：5 ng/μL模板2 μL，10 μmoL/L上下游引物各0.3 μL，2×RealStar Green Fast Mixture 10 μL，去離子水補充體系至20 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，39個循環；熒光信號采集設在72 ℃。反應結束后，設65～95 ℃的溶解曲線，溫度以0.5 ℃/5 s遞增。根據實驗結果熒光信號是否呈指數增長、定量循環數(quantification cycle,Cq)值及溶解曲線來綜合判斷結果。

1.4.7 標準曲線制備

將上述已制備的標準品進行10倍梯度稀釋(2.0×108copies/μL)～(2.0×103copies/μL)每個梯度各設3個平行進行重復試驗，設置無模板對照(no template control,NTC)，建立標準曲線并檢驗方法的靈敏度。

1.4.8 特異性實驗

提取本實驗室的基因組DNA，包括大腸桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌、金黃色葡萄糖球菌、腸球菌、擬桿菌進行特異性檢測，A.muciniphila菌為陽性對照。

1.4.9 統計分析

實驗結果采用絕對定量，繪制標準曲線，檢測方法靈敏度和特異性，統計方法用CFX96TM實時PCR檢測儀進行ΔCt分析，計算每組基因拷貝數均數±標準差值，以空白對照組(control group)作為對照參考，每組8個樣本，各設置3個平行。

2 結果

2.1 標準曲線的制備及方法靈敏度

(2.0×108copies/μL)～(2.0×103copies/μL)6個梯度，每個梯度3個平行進行重復試驗的A.muciniphila基因qPCR擴增結果呈指數增長期的曲線平行擴增(圖1)，熔解曲線均出現特異性單峰(圖2)顯示峰值在87.5 ℃，NTC結果顯示個別有雜峰，Cq值在31左右，與2.0×103copies/μL的Cq值27左右相差值約3.32，基本符合BIO-RAD公司提供的實時熒光定量PCR國際化標準,即MIQE指南的10倍梯度稀釋，MIQE指南即發表實時熒光定量PCR實驗所須提供的最低信息量(Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments)，故推斷方法的靈敏度為2.0×102copies/μL。R2=0.998，斜率為-3.512符合MIQE中要求的3.3～3.8之間標準，截距為39.033，擴增效率92.6%符合MIQE 90%～105%的標準。因標準曲線以10倍濃度稀釋，根據以上信息，以DNA拷貝數為橫坐標，Cq值為縱坐標生成標準曲線(圖3)，線性關系為Cq=-3.512×lgX+39.093，即X=10^[(Cq-39.033)/-3.512]，其中X為qPCR結果對應的拷貝數copies/μL，線性良好，可用于定量分析。

注:①～⑥：2.0×108，2.0×107，2.0×106，2.0×105，2.0×104，2.0×103copies/μL；⑦：NTC。圖1 A.muciniphila菌qPCR靈敏度實驗擴增曲線

圖2 A.muciniphila菌qPCR靈敏度實驗熔解曲線

圖3 A.muciniphila菌qPCR靈敏度與重復性實驗標準曲線

2.2 方法特異性

除A.muciniphila菌為陽性對照樣本具有特異性擴增外，其余陰性樣本均出現非特異性擴增現象(圖4)，說明該方法特異性良好，可結合熔解曲線(圖5)綜合判定結果。

圖4 A.muciniphila菌qPCR特異性實驗擴增曲線

圖5 A.muciniphila菌qPCR特異性實驗熔解曲線

2.3 qPCR對各組A.muciniphila菌的定量

各組糞便中A.muciniphila菌的絕對定量檢測結果顯示呈指數增長期的曲線平行擴增(圖6)，熔解曲線均出現特異性單峰(圖7)顯示峰值在87.5 ℃，NTC結果無擴增；表1ΔCt分析情況顯示，以空白對照組為組間參照時黃連組的相對值明顯升高，美沙拉嗪組稍有降低，模型組有一定升高；如表1所示，各組A.muciniphila細菌基因拷貝數分別為空白組(1 233.11±96.03)μL，模型組(2 019.62±194.02)μL，黃連組(268 501.74±54 703.05)μL，美莎拉嗪組(871.86±73.41)μL。各組與模型組比較，空白對照組基因拷貝數約為其2倍，黃連組約為133倍，美沙拉嗪組約為0.43倍。各組樣本Cq值箱線圖顯示空白對照組內差異最小，模型組和美沙拉嗪組各自組內差異不大 ，黃連組組內差異較大，但不超過0.5，符合MIQE指南，可以進行相關分析。

圖6 A.muciniphila菌qPCR各組實驗擴增曲線

圖7 A.muciniphila菌qPCR各組實驗熔解曲線

圖8 各組樣本Cq值箱線圖

表1 各組樣本中A.muciniphila菌qPCR檢測結果ΔCt分析情況

3 討論

A.muciniphila的生存與增殖僅用腸道黏蛋白作為唯一碳源和氮源，過多種機制維持腸道穩態。黏蛋白增多癥與肥胖、糖尿病、心臟代謝疾病和輕度炎癥呈負相關[12]，其分解黏蛋白并刺激杯狀細胞合成黏蛋白達到動態平衡的特性使其成為維持腸道黏膜屏障的關鍵微生物[13]。A.muciniphila菌的代謝產物短鏈脂肪酸主要為丙酸，存在于靠近腸上皮細胞的黏液層，丙酸通過 G 蛋白偶聯受體43作用于腸道組織對機體有明確的免疫調節作用[14]。A.muciniphila菌鞭毛中的膜型毛樣蛋白Amuc_1100是Toll樣受體2的激活劑，可調節宿主免疫應答和腸道屏障功能[14]，維持體內代謝平衡，在糖尿病、肥胖癥[15]、潰瘍性結腸炎、結腸癌等多種疾病[16]中具有重要的作用，膳食對它的調控尤其顯著。高豐富度的A.muciniphila似乎有利于糞便菌群移植治療難治性慢性活動性潰瘍性結腸炎[16]。

研究顯示，二甲雙胍及一些寡聚果糖[17]、石榴鞣單寧[18]和膳食纖維[3]等可以增加腸道內A.muciniphila細菌，而相關中藥對其卻少有報道。黃連清熱燥濕，瀉火解毒，是諸多治療潰瘍性結腸炎的方劑中的主要成分，其中鹽酸小檗堿、黃連堿等多種成分在治療潰瘍性結腸炎中也具有重要作用[4]。

本研究用qPCR技術分析黃連對潰瘍性結腸炎小鼠模型結腸段A.muciniphila細菌的定殖數量變化，探討黃連對潰瘍性結腸炎腸黏膜屏障和機體炎癥反應的影響，可為黃連調控A.muciniphila細菌的定殖以改善治療潰瘍性結腸炎提供科學依據。研究結果表明，A.muciniphila細菌在模型組小鼠腸道中有一定增殖情況，這與黏蛋白在結腸炎腸道中增加有關。美沙拉嗪可輕微抑制A.muciniphila菌，可能跟其主要成分5-氨基水楊酸可用于治療結核病的抗菌藥的抗菌效果有關，也可能是因為其作用于炎癥黏膜，抑制引起炎癥的前列腺素合成和炎癥介質白三烯的形成，對腸壁炎癥有顯著的消炎作用的炎癥治療效果，從而導致引起炎癥的腸道黏蛋白分泌減少，進一步導致僅將腸道黏蛋白作為唯一碳源和氮源的A.muciniphila菌群數量減少。黃連對DSS誘導的UC模型小鼠腸道中的A.muciniphila細菌有明顯促進增殖的作用，因黃連本身與美沙拉嗪相似，都具有抑菌作用和抗炎效果，但可能抑制的菌群種類和數量不同，其具體促進A.muciniphila細菌增殖機制還需進一步研究。