POPDC2在肺癌中的功能探究

梁積峰，溫 瑤，楊博宇，林 禮，范雄偉*，張 凱，李 芳*

(1.湖南師范大學(xué)心臟發(fā)育研究中心，省部共建淡水魚類發(fā)育生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物多肽藥物創(chuàng)制國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，中國(guó) 長(zhǎng)沙 410081；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院老年病科，國(guó)家老年疾病臨床研究中心，中國(guó) 長(zhǎng)沙 410008)

目前全世界每年有180萬(wàn)～800萬(wàn)的人被確診為肺癌，其中死亡人數(shù)高達(dá)160萬(wàn)～600萬(wàn)。因環(huán)境、醫(yī)療等地區(qū)差異，肺癌的5年生存率約為4%～17%[1,2]。在中國(guó)，所有癌癥中肺癌的發(fā)病率和致死率均位于第一，肺癌死亡成為我國(guó)僅次于中風(fēng)、缺血性心臟病的第三大致死性疾病。肺癌發(fā)病機(jī)制未知，大量研究表明長(zhǎng)期吸煙、在污染的空氣中呼吸和遺傳易感性等誘因協(xié)同導(dǎo)致肺癌發(fā)生[3]。

由于不同類型肺癌亞群或克隆在腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性，肺癌的治療面臨巨大挑戰(zhàn)。新誘導(dǎo)因子和抑制因子的鑒定以及對(duì)肺癌病因?qū)W的深入了解，是發(fā)展有效的肺癌治療方法的關(guān)鍵。絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase，MAPK)信號(hào)途徑是生物體內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，參與細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞質(zhì)功能調(diào)控等過程[4,5]。通路中關(guān)鍵基因應(yīng)激活化蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)[6]以及和JNK類似的應(yīng)激活化蛋白基因P38等異常激活或抑制都會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬或凋亡[7]，并與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)[8]。細(xì)胞凋亡是維持生物內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一種重要生理機(jī)制，涉及多基因的激活、表達(dá)及調(diào)控，而細(xì)胞凋亡的抑制以及自噬的失衡是腫瘤發(fā)生的重要的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。自噬是另一種啟動(dòng)細(xì)胞程序性死亡的方式，與凋亡共同調(diào)控細(xì)胞生存和死亡[9]。抑癌基因p53的激活將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加[10]。自噬相關(guān)蛋白beclin1和LC3A/B作為自噬特異性標(biāo)記分子，介導(dǎo)細(xì)胞自噬進(jìn)而影響凋亡[11]。

Popeye結(jié)構(gòu)域(Popeye domain containing, POPDC)基因家族由POPDC1，POPDC2和POPDC3組成。POPDC基因家族編碼一類含有3個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域和一個(gè)進(jìn)化保守的細(xì)胞質(zhì)popeye結(jié)構(gòu)域的新型環(huán)磷酸腺苷 (Cyclic adenosine monophosphate，cAMP)效應(yīng)蛋白[12]。在小鼠和斑馬魚中進(jìn)行的功能缺失實(shí)驗(yàn)證實(shí)POPDC家族在骨骼肌再生、心律控制和應(yīng)激信號(hào)傳導(dǎo)方面起重要作用[13]。最近幾年，POPDC家族在癌癥中的作用研究也取得了一定進(jìn)展。乳腺癌中，POPDC1通過抑制表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)抑制癌癥的發(fā)展[14]。在肺癌中，POPDC1的甲基化程度顯著增加[15]。在胃癌中，POPDC3的低表達(dá)預(yù)示著較低的生存率[16]。然而POPDC2是否參與了肺癌的發(fā)生，在臨床樣本中POPDC2是否存在差異性表達(dá)以及POPDC2在肺癌中的細(xì)胞學(xué)功能，尚不清楚。

本研究試圖分析POPDC2在肺癌組織中的表達(dá)情況，在A549細(xì)胞中過表達(dá)POPDC2，檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞凋亡水平、相關(guān)凋亡基因和MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵基因表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 A549(人類肺腺癌肺泡基底上皮細(xì)胞)細(xì)胞系，從湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院心臟發(fā)育研究中心獲得。

1.1.2 試劑和實(shí)驗(yàn)材料 pCMV-Tag2B-POPDC2質(zhì)粒從湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院心臟發(fā)育研究中心獲得；1640細(xì)胞培養(yǎng)基和FBS購(gòu)自thermo fisher生物公司；RIPA蛋白裂解液，蛋白酶抑制劑，磷酸化酶抑制劑，蛋白印跡膜再生液/抗體剝離液以及5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購(gòu)自康為生物有限公司；POPDC2抗體，p53抗體、beclin-1抗體、LC3A/B抗體，P38抗體、p-P38抗體、JNK抗體、p-JNK抗體，β-actin抗體、GAPDH抗體、鼠二抗和兔二抗均購(gòu)自abcam生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)占所有肺癌患者的80%，最常見的類型為肺腺癌(Lung adenocarcinoma，LUAD)和肺鱗狀細(xì)胞癌(Pulmonary squamous cell carcinoma，LUSC)。使用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(鏈接http://gepia2.cancer-pku.cn/#analysis)實(shí)時(shí)分析LUAD和LUSC癌組織與正常組織的各基因表達(dá)情況。

1.2.2 A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染 步驟如下：培養(yǎng)80%融合度的A549細(xì)胞；將10 μL過表達(dá)POPDC2質(zhì)粒與100 μL轉(zhuǎn)染稀釋液混勻振蕩離心，靜置5 min；再與加入10 μL Lipo 2000的100 μL稀釋液混勻振蕩離心；靜置20 min，隨后將混合液加入A549細(xì)胞中。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 步驟：1)收集細(xì)胞3 000 r·min-1離心5 min，棄去上清；2)使用PBS漂洗2次，棄去上清；3)加入提前預(yù)冷好的PBS 1 mL，乙醇2.5 mL，4 ℃固定過夜；4)3 000 r·min-1離心5 min，棄去上清；5)用PBS漂洗2次，棄去上清，隨后加入1 mL PBS，再加入終濃度為50 g·L-1的RNase A；6)每隔5 min搖晃一次，37 ℃消化30 min；7)放在冰盒上終止消化；8)過一次38 μm的尼龍篩放入流式上樣管中；9)加入50 μL含1% Triton的PI，室溫避光染色5 min。

1.2.4 細(xì)胞總蛋白提取 吸棄1640培養(yǎng)基后，用PBS漂洗3次；用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，收集到一個(gè)1.5 mL的離心管中，加入適量裂解液，封上封口膜，用細(xì)胞超聲破碎儀破碎20次，每次5 s，間隔5 s，隨后冰上裂解15 min；再按照說明書加入終濃度為1×的SDS蛋白上樣緩沖液，用漩渦震蕩機(jī)混勻之后放入沸水浴10 min，然后12 000 r·min-1離心10 min取上清，分管凍存在-80 ℃。

1.2.5 免疫印跡(Western Blot)分析 先根據(jù)目的蛋白目的條帶選擇合適的蛋白膠濃度，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)Marker條帶大小取所需要的蛋白條帶，轉(zhuǎn)移到NC 膜上牛奶封閉，孵育一抗；洗滌，孵育二抗；洗滌，滴加蛋白顯影液后于顯影儀上顯影。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)用T檢驗(yàn)的方法進(jìn)行顯著性分析統(tǒng)計(jì)差異，*P<0.05即具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。利用Graphpadprism 7制圖。

2 結(jié)果

2.1 POPDC2在肺癌組織中的表達(dá)

使用GEPIA平臺(tái)對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)TCGA中LUAD和LUSC的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行分析。選取483例LUAD和486例LUSC癌組織，另取相應(yīng)的癌旁正常組織作為對(duì)照，對(duì)POPDC2在不同組織中的表達(dá)水平進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于對(duì)照，POPDC2在LUSC和LUAD中顯著下調(diào)(圖1)。

T：肺癌組織；N：癌旁正常組織；*P<0.05。

2.2 pCMV-tag2B-POPDC2質(zhì)粒在A549細(xì)胞系中表達(dá)POPDC2蛋白

將pCMV-tag2B-POPDC2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到A549中，表達(dá)48 h后提取總蛋白，使用POPDC2特異性抗體進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明POPDC2蛋白表達(dá)水平顯著提高(圖2)。

圖2 POPDC2在A549中過表達(dá)

2.3 POPDC2影響細(xì)胞凋亡

在長(zhǎng)滿的A549細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒和pCMV-Tag2B-POPDC2過表達(dá)質(zhì)粒48 h后，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染POPDC2過表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞，凋亡數(shù)目比例顯著增加(圖3)。

圖3 過表達(dá)POPDC2后細(xì)胞凋亡情況

2.4 POPDC2對(duì)凋亡相關(guān)基因的影響

p53,beclin和LC3A/B是細(xì)胞凋亡和自噬的重要標(biāo)志性基因。對(duì)轉(zhuǎn)染了空載和pCMV-tag2B-POPDC2質(zhì)粒的A549細(xì)胞提取總RNA，使用qPCR檢測(cè)其mRNA表達(dá)變化情況。結(jié)果表明，過表達(dá)POPDC2會(huì)顯著上調(diào)A549細(xì)胞中的p53，beclin和LC3A/B的轉(zhuǎn)錄水平(圖4)。

數(shù)據(jù)來自3組實(shí)驗(yàn)重復(fù)，*P<0.05，****P<0.0001。

隨后提取總蛋白，通過WB檢測(cè)這3個(gè)基因的蛋白表達(dá)差異。結(jié)果表明，過表達(dá)POPDC2后，p53，beclin和LC3A/B的蛋白水平均顯著增加(圖5)。

2.5 POPDC2對(duì)MAPK信號(hào)通路相關(guān)基因的影響

MAPK信號(hào)通路異常與癌癥發(fā)生緊密相關(guān)，JNK和P38作為該通路中的分子標(biāo)記，與細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡都有關(guān)。對(duì)過表達(dá)POPDC2后的樣品檢測(cè)其JNK，P38以及相應(yīng)的蛋白磷酸化水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JNK和P38蛋白表達(dá)較于對(duì)照沒有發(fā)生明顯變化，但是二者的磷酸化水平都發(fā)生了顯著上調(diào)(圖6)。

a：凋亡/自噬相關(guān)基因在過表達(dá)POPDC2后的蛋白差異表達(dá);b：蛋白表達(dá)量化統(tǒng)計(jì)。數(shù)據(jù)來自3組實(shí)驗(yàn)重復(fù)，*P<0.05。

a：MAPK通路相關(guān)基因在過表達(dá)POPDC2后的蛋白水平，b：磷酸化蛋白表達(dá)量統(tǒng)計(jì)。數(shù)據(jù)來自3組實(shí)驗(yàn)重復(fù)，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

本研究使用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)首次分析了POPDC2在LUAD和LUSC中的表達(dá)情況。數(shù)據(jù)顯示，POPDC2在兩種肺癌亞型中都有所下調(diào)，提示POPDC2和肺癌之間具有一定的關(guān)聯(lián)。一項(xiàng)對(duì)49例非小細(xì)胞肺癌患者癌組織的POPDC1基因甲基化水平檢測(cè)研究中發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于正常組織，癌組織甲基化頻率顯著增加[15]。POPDC3表達(dá)也是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。有研究表明，在306例胃癌患者中，存在228例POPDC3低表達(dá)。使用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析顯示，低表達(dá)POPDC3的早期胃癌患者3年生存率降低51.9%，晚期胃癌患者為32.6%[16]。研究提示POPDC2可能與直腸癌發(fā)生存有相關(guān)，在耐藥結(jié)性直腸癌細(xì)胞系中，POPDC2表達(dá)水平較低[17]。這一結(jié)果與本研究的生物信息學(xué)分析相一致，說明POPDC2與肺癌的發(fā)生可能相關(guān)。

cAMP是一種普遍存在的第二信使，通過蛋白激酶A (protein kinase A system，PKA)的激活調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生物學(xué)過程[18]，包括細(xì)胞周期阻滯、自噬、遷移、凋亡[19]。淋巴細(xì)胞中cAMP的長(zhǎng)期升高可促進(jìn)淋巴樣細(xì)胞的生長(zhǎng)阻滯和凋亡，尤其是不成熟淋巴樣細(xì)胞。使用霍亂毒素在小鼠T淋巴瘤細(xì)胞增加cAMP水平能誘發(fā)細(xì)胞凋亡[20]。在As2O3誘導(dǎo)凋亡的人乳腺癌細(xì)胞中，POPDC2基因的表達(dá)顯著上調(diào)[21]，提示POPDC2可能參與癌癥化療誘發(fā)的細(xì)胞凋亡。筆者使用流式細(xì)胞術(shù)分析也證實(shí)，過表達(dá)POPDC2能促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡，與同行們?cè)谌橄侔┲械难芯拷Y(jié)果相一致，提示POPDC2可能通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，抑制肺癌的發(fā)生。

POPDC2對(duì)肺癌的促凋亡作用機(jī)制可能是通過JNK和P38實(shí)現(xiàn)的。有研究發(fā)現(xiàn)，JNK和P38的活化能誘發(fā)細(xì)胞凋亡。使用甘草查爾酮A處理人鼻咽癌細(xì)胞系NPC-BM后JNK和P38磷酸化水平顯著增加，通過MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞活力顯著降低，同時(shí)伴隨著細(xì)胞凋亡顯著增加[22]。使用棕櫚酸酯處理人肝癌細(xì)胞系Huh-7后，死亡受體DR5mRNA水平顯著上調(diào)，JNK蛋白磷酸化水平顯著上升[23]。在人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-116中失活P38會(huì)阻斷三酰基甘油的合成，減緩細(xì)胞凋亡過程中脂滴的聚集[24]，表明P38能介導(dǎo)結(jié)腸癌的細(xì)胞凋亡。筆者通過免疫印跡檢測(cè)同樣發(fā)現(xiàn)POPDC2過表達(dá)顯著增加了P38和JNK蛋白磷酸化水平。提示POPDC2過表達(dá)激活P38和JNK蛋白磷酸化，隨后誘導(dǎo)A549肺癌細(xì)胞凋亡。

p53也是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控因子。p53的調(diào)控與P38的活性有關(guān)，有學(xué)者使用依托泊苷誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞構(gòu)建DNA損傷模型后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡的同時(shí)，p53蛋白水平顯著上調(diào)并伴隨著P38的磷酸化水平顯著增加[25]。本研究也顯示，過表達(dá)POPDC2的肺癌細(xì)胞中p53表達(dá)上調(diào)，但其調(diào)控的具體分子機(jī)制尚不明確。此外，beclin1和LC3A/B可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬影響細(xì)胞凋亡。JNK的活化參與細(xì)胞自噬的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，在人肝癌細(xì)胞HCC中過表達(dá)骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP4后，beclin1和LC3蛋白水平上調(diào)，且伴隨著JNK的磷酸化激活，隨后使用JNK高選擇性抑制劑SP600125處理發(fā)現(xiàn)beclin1和LC3的表達(dá)顯著降低[26]。在過表達(dá)POPDC2的肺癌細(xì)胞中，beclin1和LC3A/B蛋白水平顯著上調(diào)，這有可能是JNK信號(hào)被活化的緣故。但是，JNK相關(guān)的自噬在POPDC2促凋亡過程中發(fā)揮多大作用及其作用機(jī)制尚不清楚,值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究證實(shí)POPDC2促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡。在肺癌的病理發(fā)生中，POPDC2的表達(dá)下調(diào)有可能喪失其對(duì)肺癌細(xì)胞的促進(jìn)作用從而調(diào)控肺癌的發(fā)生，本研究為臨床診斷和干預(yù)肺癌的發(fā)生提供了新的分子靶標(biāo)。