miR-218 靶向LASP1 調控TGF-β/Smad 信號通路調節肺癌細胞的侵襲和轉移

張 苑 韓鵬凱 王 靜 張 婷 （重慶市渝北區人民醫院老年醫學科，重慶401120）

肺癌作為世界上發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，占所有癌癥死亡總數的三分之一［1-2］。近年來肺癌的發病率呈逐年上升趨勢，嚴重危害著人類健康［3］。肺癌本身的發病原因多樣，涉及的分子機制復雜，導致肺癌患者的長期生存率及治療預后并不理想。相關研究表明非編碼小分子RNA（microRNA，miRNA）是一類由19~22 個核苷酸組成的小分子RNA，其可通過調節相關基因發揮促癌或者抑癌作用，與腫瘤密切相關，在細胞增殖、凋亡以及侵襲等過程中至關重要［4］。近期有文獻報道，miRNA-218 在多種腫瘤中表達下調，包括肺癌、胃癌、鼻咽癌、膠質母細胞瘤等［5-6］。此外，LASP1 是一種肌動蛋白支架蛋白，相關研究表明其在癌組織中呈高表達，調節癌細胞的增殖與分化［7］。因此，本研究以A549 肺癌細胞作為模型細胞，探討miR-126 對肺癌細胞生物學行為的影響并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本 收集 2018 年 1 月至 2019 年 5 月于重慶市渝北區人民醫院就診的62 例非小細胞肺癌患者癌組織及距離癌組織超過2 cm 處的正常組織，經組織病理學檢測證實為腺癌或鱗癌。所有入選患者在術前均未進行放化療和其他治療且臨床病理資料完整。62例肺癌患者，年齡25~65歲，平均（38.64±11.28）歲；TNM 分期：Ⅰ期患者12 例，Ⅱ期患者7 例，Ⅲ期患者25 例，Ⅳ期患者18 例；腫瘤直徑＜5 cm 患者 20 例，≥5 cm 患者 42 例；組織學分級：中高分化患者41例，低分化患者21例；共有35例發生區域淋巴結轉移。所有患者均已簽署知情同意書，且經我院倫理委員會審核批準后收集標本。

1.1.2 試劑與儀器 高轉移人肺腺癌細胞系A549 細胞株購自上海中科院細胞庫；miRNA-218購自GeenPharma；胎牛血清購自Biowest 公司；CCK-8購自 Sigma 公司；RPMI1640 培養基、結晶紫、ECL Plus 超敏發光液購自北京索萊寶公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；轉染試劑Lipofectamine、TRIzol 試劑盒購自Invitrogen 公司；RIPA 裂解液Ⅰ、LASP1、TGF-β、Smad 一抗以及GAPDH 購自英國Abcam 公司，山羊血清及辣根過氧化物酶標記的二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

轉膜儀及電泳儀購自北京六一儀器廠；倒置顯微鏡購自Olympus；冷凍冷藏兩用冰箱購自Siemens；多功能酶標儀購自Thermo Fisher；ABI 7500實時熒光定量PCR 儀購自Applied Biosystems；高速離心機購自Eppendorf。

1.2 方法

1.2.1 實時定量熒光PCR 檢測miRNA-218 的表達 取病理標本加入組織裂解液，收集上述細胞各1×107個，采用TRIzol 試劑重懸，反復吹打充分裂解細胞，之后根據試劑說明書提取總RNA 并對RNA濃度及純度進行檢測。使用的序列如下：miR-218引物（正向：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'），反 應 條 件 ：95℃ 預變性 30 s；95℃ 變性 30 s；58℃ 退火30 s；72℃延伸50 s，共40個循環，每組重復3次，以β-actin（正向：5'-ACACTCCAGCTGGGTTGATCTAA-3'，反向：5'-GGAAGATGGTGATGGGATT-3'）作為擴增內參，相對表達量用 2-ΔΔCt表示。

1.2.2 免疫組化檢測LASP1 和TGF-β 表達 組織切片常規脫蠟和水化后置于PBS 緩沖液中高壓修復，然后用3%雙氧水室溫下浸泡以阻斷內源性過氧化物酶，封閉，分別加入稀釋好的一抗4℃孵育過夜，次日復溫后PBS 洗滌干凈，分別加稀釋好的二抗，室溫孵育30 min，PBS 洗滌。加適量DAB 孵育5 min，去離子水終止反應，蘇木素復染5 min，無菌水沖洗后，不同濃度梯度乙醇脫水2 h，無菌濾紙吸凈表面殘存液體，二甲苯透明，用中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察組織形態并拍攝。

病理切片需由2 位資深專業的病理科醫師盲評。在每張切片上隨機選取5 個高倍鏡視野，每個視野隨機對200 個細胞進行計數，陽性表達為細胞出現棕黃色或黃色顆粒，最終以組織樣本中陽性細胞染色強度及其所占比例對染色結果進行綜合評定。染色強度計分依據：按照無著色、淡黃色、棕黃色及棕褐色順序分別計 0 分、1 分、2 分、3 分。陽性細胞數計分：按照無陽性細胞＜25%、陽性細胞26%~50%、陽性細胞51%~75%、陽性細胞＞75%分別計0 分、1 分、2 分、3 分。以上兩項計分相加后≥3 判為陽性。

1.2.3 實驗細胞培養 肺癌細胞A549 采用RPMI1640 完全培養基（10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素抗生素溶液）在37℃、5%CO2細胞培養箱中培養。細胞3 d傳代1次，選擇處于對數生長期且狀態良好的細胞使用胰酶消化。構建miRNA-218 的慢病毒表達質粒，取3 μg miRNA-218的慢病毒表達質粒以及慢病毒表達空質粒分別與5 μg Packaging Mix 混合后加入RPMI1640 培養基中，輕輕混勻后加入 15 μl 的轉染試劑 Endo FectinTM-Lenti，室溫孵育30 min后將混合液緩慢加入到A549肺癌細胞，細胞培養箱中繼續培養48 h后收集細胞用于后續實驗。

1.2.4 CCK-8 及平板克隆實驗檢測細胞增殖 細胞以密度為5×104個/ml接種于96孔板（每孔100 μl），分為空白對照組（未進行轉染細胞，Blank group）、空載體組（轉染空載體細胞，Control group）、miRNA-218 組（轉染 miRNA-218 細胞，miRNA-218 group）每組設 6 個復孔，繼續培養 24 h 后，每孔加 10 μl 的CCK-8 溶液，于37℃細胞培養箱中避光孵育2 h 后，將96孔板置于多功能酶標儀中檢測450 nm 處的吸光度值。

將上述消化下來的各組細胞按5×103個/孔鋪于6 孔板繼續培養，隔周更換新鮮培養液，2 周后用考馬斯亮藍染色，以大于30個細胞的克隆記為一個菌落，在顯微鏡下觀察并拍照記錄菌落形成數量，每組設3個復孔，重復實驗3次。

1.2.5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 將1.2.4 中各組細胞密度調整為 5×104個/ml 后接種于 12 孔板，每孔加入2 ml 細胞液，于37℃細胞培養箱孵育24 h，待形成細胞單層后，將培養液更換為無血清培養基進行饑餓處理12 h 后，使用200 μl 槍頭在細胞層進行劃痕，加入2 ml 的PBS 洗3 次去除劃痕產生的細胞碎片，加入含有1%FBS的RPMI640培養基進行培養，孵育36 h 后采用倒置顯微鏡觀測細胞遷移狀況，采用圖片處理軟件Image J對細胞遷移進行定量分析。

1.2.6 Transwell 實驗檢測細胞侵襲能力 實驗前將細胞饑餓處理，采用無血清培養基培養12 h，之后采用胰酶消化細胞，將細胞密度調整為2×105個/ml，實驗分組同1.2.4，每組200 μl 相應的各細胞懸液接種于Matirge 膠預先包被好的Transwell 小室上室中，并在下室加入 600 μl 含 10%FBS、1% 雙抗的RPMI1640 培養基，之后置于細胞培養箱中培養24 h 后將小室取出，每孔加入 500 μl 的 PBS 洗滌3 次后加入甲醇固定30 min，使用棉簽輕輕擦掉小室上層未侵襲的細胞，之后用0.1%結晶紫染色，倒置顯微鏡下取5個視野觀察并計數穿過小室下層的細胞個數。

1.2.7 流式細胞術檢測肺癌細胞凋亡率 胰蛋白酶消化各組細胞，PBS 洗滌細胞2 次，buffer 緩沖液重懸吹打混勻，調整各組細胞個數約為1×105個，加入5 μl Annexin V-FITC，使用移液槍混合均勻后加入 5 μl PI，靜置 15 min 后，過濾上樣，流式細胞儀測定各組細胞的凋亡率。

1.2.8 生物信息學預測及熒光素酶基因報告分析 使用生物信息學網站StarBase 預測miRNA-218可互補結合的基因。通過miRBase 數據庫獲得人的miRNA-218 和 LASP1 基因序列，以 HNEC 細胞基因組DNA 為模板，PCR 擴增LASP1 的3'-UTR，構建野生型重組質粒LASP1-WT，同時構建突變型重組質粒LASP1-mutant。將HEK293T細胞按5×105細胞/孔鋪于 24 孔板，將 miRNA-218 mimic、mimic control 分別與上述質粒共轉染至HEK293T細胞，以空載質粒作為對照。轉染后24 h，根據雙熒光素酶測定試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

1.2.9 Western blot 檢測 收集上述細胞并加入RIPA 裂解液 200 μl 裂解 15 min，13 000/rmin 離心5 min 收集上清。BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白含量，加上樣緩沖液后煮沸變性3 min，以制備蛋白樣品，每組上樣 20 μg 蛋白，10%SDS-PAGE 分離膠電泳，轉膜，室溫5%脫脂奶粉封閉2 h，加入稀釋后的LASP1一抗（1∶1 000）、TGF-β 一抗（1∶500）、Smad一抗（1∶500）以及GAPDH 一抗（1∶500），搖床4℃ 孵育過夜。次日用PBST 將PVDF 膜洗凈并加入稀釋好的 HRP，37℃ 條件下孵育 2 h，ECL 顯影拍照，使用Image J 軟件分析條帶，以GAPDH 為內參計算蛋白的相對表達量。

1.3 統計學分析 實驗數據采用GraphPad Prism 5、SPSS21.0進行分析處理，以來表示，采用獨立樣本t檢驗進行兩組數據比較，以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-218 在肺癌組織中的表達 qRT-PCR結果顯示，肺癌組織中miRNA-218 的表達水平顯著低于正常組織（P＜0.05），結果見圖1。

圖1 肺癌及癌旁正常組織中miRNA-218的表達Fig.1 Expression of miRNA-218 in lung cancer and adja?cent normal tissues

2.2 LASP1 和 TGF-β 在 肺 癌 組 織 中 的 表 達LASP1、TGF-β 在肺癌組織中的陽性表達率分別為83.87%、77.42%，在正常肺組織中分別為19.35%、16.12%，差異有統計學意義（χ2=46.582、37.861，P均＜0.000 1），見圖2。

圖2 LASP1和TGF-β在肺癌及癌旁組織中的表達（×400）Fig.2 Expressions of LASP1 and TGF-β in lung cancer and paracancer tissues（×400）

2.3 肺癌組織中miRNA-218 的表達情況與患者臨床病理特征之間的關系 取miRNA-218 在肺癌組織中相對表達量差異倍數的中位數作為截點，將肺癌患者分為兩組，大于中位數為高表達組（n=12）、小于中位數為低表達組（n=50），統計學分析結果顯示，miRNA-218 表達水平與患者腫瘤浸潤深度（P=0.004）、腫瘤大小（P=0.005）、淋巴結轉移（P=0.014）以及TNM 分期（P=0.021）密切相關，而與其他臨床特征包括年齡（P=0.610）、Her2 狀態（P=0.604）以及分化程度（P=0.340）無相關性，見表1。

表1 miRNA-218表達與肺癌臨床病理參數間的關系Tab.1 Correlation between miRNA-218 expression and clinicopathological parameters of lung cancer

2.4 miRNA-218 在肺癌細胞中的表達 與空白對照組比較，miRNA-218 組中miRNA-218 相對表達量顯著升高（P＜0.05），空載體組與空白對照組相比無明顯差異（P＞0.05），結果見圖3。提示成功構建了miRNA-218過表達細胞系。

圖3 miRNA-218在肺癌細胞中的表達Fig.3 miRNA-218 expression in lung cancer cells

2.5 miRNA-218 對于肺癌細胞增殖能力的影響 與空白對照組比較，miRNA-218 組細胞克隆數及增殖率有顯著降低（P＜0.05），空載體組與空白對照組相比無明顯差異（P＞0.05），結果見圖4。

圖4 miRNA-218對肺癌細胞增殖的影響Fig.4 Effect of miRNA-218 on proliferation of lung can?cer cell

2.6 miRNA-218 對于肺癌細胞遷移能力的影響 miRNA-218 組細胞遷移率相比于空白對照組有顯著降低（P＜0.05），空載體組與空白對照組差異無統計學意義（P＞0.05），結果見圖5。

圖5 miRNA-218對于肺癌細胞遷移能力的影響Fig.5 Effect of miRNA-218 on migration ability of lung cancer cells

2.7 miRNA-218 對于細胞侵襲能力的影響 相比于空白對照組，miRNA-218 組細胞侵襲個數有顯著減少（P＜0.05），空載體組與空白對照組相比無明顯差異（P＞0.05），結果見圖6。

圖6 miRNA-218對于肺癌細胞侵襲能力的影響Fig.6 Effect of miRNA-218 on invasion ability of lung cancer cells

2.8 miRNA-218 對于細胞凋亡能力的影響 相比于空白對照組，miRNA-218 組細胞凋亡比例有顯著增高（P＜0.05），空載體組與空白對照組相比無明顯差異（P＞0.05），結果見圖7。

圖7 miRNA-218對于肺癌細胞凋亡的影響Fig.7 Effect of miRNA-218 on apoptosis of lung cancer cells

2.9 生物信息學預測 使用StarBase 預測軟件分析，結果顯示miRNA-218 與LASP1 具有最高的匹配預測值。證明miRNA-218 與LASP1 存在靶向結合位點；雙熒光素酶報告基因結果顯示，轉染miRNA-218 后，LASP1 野生型的熒光素酶活性被抑制（P＜0.05），而LASP1 突變型的熒光素酶活性無明顯變化，說明miRNA-218 與LASP1 具有靶向調控關系，結果見圖8。

圖8 雙熒光素酶實驗結果Fig.8 Experimental results of double luciferase

2.10 LASP1、TGF-β 及 Smad 的蛋白表達水平 miRNA-218 組細胞 LASP1、TGF-β 及 Smad 蛋白表達相比于空白對照組顯著降低（P＜0.05），空載體組與空白對照組相比無顯著變化，結果見圖9。

圖9 LASP1、TGF-β及Smad蛋白表達水平Fig.9 LASP1，TGF-β and Smad protein expression levels

3 討論

肺癌病因復雜，涉及因素眾多［8］。國內外關于肺癌的發病過程以及肺癌的診斷治療有較為廣泛的研究，但是對于晚期肺癌患者以及術后轉移復發的患者治療效果仍然不理想，五年生存率僅為16%左右［9-10］。造成肺癌患者死亡的主要原因是癌細胞的增殖、遷移和侵襲轉移。因此，深入研究肺癌遷移、侵襲轉移過程的相關機制對于改善肺癌治療現狀以及提高患者預后至關重要。

miRNA 是一種主要通過沉默特異性基因來發揮功能的非編碼RNA，其長度約為22 nt［11］。近年來，miRNA 在腫瘤的發生及發展進程中的作用備受關注，miRNA 參與多種疾病的生理、病理過程，對疾病的發生發展有顯著影響，主要包括調節細胞增殖、凋亡以及遷移等。腫瘤的發生及發展進程涉及多基因調控、過程復雜，相關研究報道：某些miRNA可直接參與腫瘤的形成，相反某些miRNA 可以抑制腫瘤的形成［12］，但是關于miRNA 發揮作用的分子機制尚不清楚。在多種腫瘤組織中miRNA-218 出現低表達狀況，例如在肺癌、胃癌、鼻咽癌、膠質母細胞瘤［13］。有研究證實：miRNA-218 可抑制腫瘤細胞的增殖，發揮抑癌基因的作用，通過對miRNA-218表達的促進可抑制相關腫瘤細胞的增殖，暗示miRNA-218 可能與抑制癌癥進程息息相關［14］。本研究顯示，肺癌組織中miRNA-218 的表達水平低于正常組織，且其表達水平與患者腫瘤浸潤深度、腫瘤大小、淋巴結轉移以及TNM 分期密切相關，提示miRNA-218參與了肺癌的進展和轉移。

LASP1是近年來發現的一種新的肌動蛋白結合蛋白和斑聯蛋白支架蛋白，有研究表明LASP1 在高侵襲轉移癌中的表達水平顯著升高，表明它可能是腫瘤細胞侵襲轉移過程中的重要分子，與腫瘤的發展密切相關［15-16］。本研究同樣發現，肺癌組織中LASP1、TGF-β 的表達顯著增加，提示其參與肺癌的發生發展，以往的研究表明，miRNA-218 與LASP1兩者存在互補結構，證明LASP1 可能是miRNA-218的靶基因［17］。本研究通過生物信息學分析及熒光素酶報告基因實驗，也驗證了miRNA-218 與LASP1存在靶向作用關系。關于miRNA-218 與LASP1 對于肺癌發展進程的影響尚未有研究。因此，本研究通過構建miRNA-218 過表達肺癌A549 細胞系來探討miRNA-218 與LASP1 對于肺癌進程的影響并驗證兩者之間的關系，相比于空白對照組，轉染miRNA-218的A549肺癌細胞的增殖、遷移以及侵襲能力顯著抑制。此外，轉染miRNA-218的A549肺癌細胞的LASP1 蛋白的表達水平明顯降低。TGF-β/Smad 信號通路在腫瘤的發生發展中扮演了重要角色，相關研究表明：包括肺癌在內的多種腫瘤的發生伴隨著TGF-β通路的異常［18］。TGF-β被激活后具有生物學活性，可進一步誘導Smad 磷酸化并與Co-Smad形成異源復合物移轉移至細胞核內，調節相關靶基因的轉錄［19］。有研究認為 TGF-β/Smad 通路是治療肺癌的靶點之一［20］。研究發現，LASP1 蛋白促進直腸癌的進展可能是通過參與激活TGF-β/Smad信號通路從而促進結直腸癌細胞的侵襲性和上皮間之轉化功能［21］。本研究對過表達miRNA-218 的A549 細胞的 TGF-β 及 Smad 蛋白含量進行檢測，結果表明：轉染miRNA-218的A549肺癌細胞的TGF-β及Smad 蛋白表達水平顯著降低。以上結果提示，miRNA-218 抑制肺癌細胞遷移、侵襲的作用可能是通過抑制 LASP1 蛋白介導的 TGF-β/Smad 通路實現的。

綜上所述，本研究體外驗證了miRNA-218 通過抑制 LASP1 蛋白的表達，進而抑制 TGF-β/Smad 通路，導致肺癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力受到抑制，當然本研究也存在一定的不足之處，譬如調控LASP1 蛋白表達，TGF-β/Smad 通路是否發生變化？因此，下一步我們將構建LASP1 過表達/沉默肺癌細胞系，進一步探討其作用機制。