平肝止癇復(fù)方聯(lián)合卡馬西平通過(guò)HMGB1/ TLR4/ NF-κB 通路對(duì)難治性癲癇大鼠神經(jīng)元損傷的影響①

劉運(yùn)權(quán) 李若照 郭磊磊 婁金波 姚 娟 安運(yùn)佳 熊保月 王 強(qiáng)

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，貴陽(yáng)550000）

癲癇是由神經(jīng)元異常放電引起大腦功能紊亂的疾病，其病程長(zhǎng)、臨床反復(fù)發(fā)作、突發(fā)突止［1-2］。目前抗癲癇藥物如：卡馬西平、苯妥英鈉、左乙拉西坦片等藥物能夠控制病情的發(fā)作，但是還有約30%的癲癇患者無(wú)法通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間服用抗癲癇藥物得到改善［3］，這部分難治性癲癇患者要面對(duì)癲癇的高頻次發(fā)作。因此，探索難治性癲癇的發(fā)病機(jī)理，尋找針對(duì)此類(lèi)患者的有效干預(yù)藥物，有著非常重大的臨床意義。

中醫(yī)藥對(duì)難治性癲癇的診治有多靶點(diǎn)、多途徑及毒副作用小的優(yōu)勢(shì)［4］。近年來(lái)文獻(xiàn)表明，中藥聯(lián)合抗癲癇西藥治療癲癇的效果要好于單用抗癲癇西藥［5-6］。平肝止癇復(fù)方是本團(tuán)隊(duì)通過(guò)總結(jié)臨床經(jīng)驗(yàn)研究的復(fù)方藥，由天麻、水劍草、全蟲(chóng)、郁金、膽星組成。通過(guò)平肝止癇復(fù)方聯(lián)合卡馬西平治療臨床上確診的難治性癲癇患者有著較好的療效［7］。然而其機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

炎癥反應(yīng)在癲癇的產(chǎn)生和發(fā)展中有著極為重要的作用。癲癇的反復(fù)發(fā)作能夠?qū)е履X內(nèi)炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)既是癲癇發(fā)作的結(jié)果，同時(shí)也可能是導(dǎo)致癲癇反復(fù)發(fā)作的原因之一［8-9］。高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）參與自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病和心血管疾病等的發(fā)生和發(fā)展。HMGB1 可以從受損的神經(jīng)元細(xì)胞釋放到胞外，通過(guò)作用于細(xì)胞膜上RAGE 受體和Toll樣受體如TLR4 的活化完成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，這些活化后的受體能誘導(dǎo)NF-κB 的激活，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)，活化免疫細(xì)胞進(jìn)而加重腦損傷［10-11］。研究表明，HMGB1作為神經(jīng)炎癥的放大因子，其激活與癲癇的進(jìn)程有關(guān)［12］。為了更深入探索HMGB1/TLR4/NF-κB 信號(hào)通路對(duì)難治性癲癇的影響，尋求治療難治性癲癇的突破口。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討平肝止癇復(fù)方聯(lián)合卡馬西平對(duì)難治性癲癇大鼠在炎癥反應(yīng)及HMGB1/TLR4/NF-κB 信號(hào)通路的作用，進(jìn)一步探討平肝止癇復(fù)方聯(lián)合卡馬西平對(duì)癲癇的作用和機(jī)制，為開(kāi)拓中西醫(yī)結(jié)合抗癲癇思路及開(kāi)發(fā)有效的抗癲癇經(jīng)典方提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 44 只SPF 級(jí)雄性Wistar 大鼠，6周齡，體重（190±20）g，購(gòu)自成都達(dá)碩有限公司，許可證號(hào)：SCXK（川）2015-30。

1.1.2 平肝止癇復(fù)方 平肝止癇復(fù)方中藥飲片組成：天麻20 g、水劍草10 g、全蟲(chóng)6 g、膽星10 g及郁金12 g均購(gòu)自貴陽(yáng)中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥免煎顆粒沖劑配方，取免煎顆粒沖劑藥物于蒸餾水中振蕩溶解后濃縮為0.48 g/ml濃度的藥液。

1.1.3 主要試劑 TUNEL 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：40308ES20）購(gòu)自上海翊圣生物有限公司；IL-1β（批號(hào)：E-EL-R0012c）、IL-6（批號(hào)：E-EL-R0015c）、TNF-α（批號(hào)：E-EL-0162c）和TGF-β1（批號(hào)：E-EL-R0019c）的ELISA 測(cè)定試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物公司；TRIzol 試劑（批號(hào)：15596018）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：RR036Q）和TaKaRa熒光定量試劑盒（批號(hào)：RR820A）購(gòu)自大連寶生物技術(shù)公司；兔單抗高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）（批號(hào)：ab79823）、兔單抗 Toll樣受體 4（Toll like receptor 4，TLR4）（批號(hào)：ab95562）和兔單抗核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）（批號(hào)：ab16502）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物造模和分組 大鼠于溫度21~25℃、濕度40%~65%條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后開(kāi)始造模［13］。36 只大鼠麻醉后，通過(guò)腦立體定位儀器于右側(cè)海馬腹后部 CA3 區(qū)緩慢注射 1 μg/ml 的紅藻氨酸 2 μl，注射后留針5 min 再緩緩拔出注射器，注射口通過(guò)螺絲封住，于相應(yīng)的左側(cè)顱骨定位處以牙鉆打孔并通過(guò)螺絲封住，隨后用牙科水泥對(duì)兩處封口并將記錄電極連接在螺絲上，最后縫合頭皮。假手術(shù)組大鼠于同樣顱骨定位處給予同體積的生理鹽水，術(shù)后對(duì)大鼠行為學(xué)進(jìn)行觀察并記錄。采用Racine 評(píng)分法進(jìn)行分級(jí)評(píng)分。造模后出現(xiàn)Ⅳ級(jí)評(píng)分以上的大鼠視為癲癇造模成功，Ⅳ級(jí)以下評(píng)分的大鼠棄用。癲癇模型大鼠制備成功后，大鼠每天灌胃0.03 g/kg的苯妥英鈉，每天1次連續(xù)14 d后，再進(jìn)行行為學(xué)觀察，仍有25 只癇性發(fā)作大鼠，歸為成功的難治性癲癇大鼠，模型成功率69.4%。最后隨機(jī)選取制備成功的24 只模型大鼠分為模型組、卡馬西平［0.03 g/（kg·d）］組和平肝止癇復(fù)方［4.8 g/（kg·d）］聯(lián)合卡馬西平［0.03 g/（kg·d）］組，每組8只大鼠，另加假手術(shù)組8只。造模結(jié)束后各組大鼠給予相應(yīng)藥物或生理鹽水，藥量通過(guò)人與大鼠的體表面積比值換算，每天給藥1 次，給藥體積10 ml/kg，給藥28 d后處死大鼠取材。

1.2.2 HE 染色觀察大鼠海馬組織 取大鼠海馬組織于4%多聚甲醛中固定48 h，經(jīng)過(guò)逐步脫水，石蠟包埋后，5 μm 的厚度切片，脫蠟后蘇木素染色，1%的鹽酸酒精分化，伊紅染色，中性樹(shù)膠封片，拍照觀察。

1.2.3 ELISA 檢測(cè)大鼠血清中IL-1β、IL-6、TGF-β1和TNF-α 的含量 末次給藥后大鼠眼眶取血，低溫高速離心分離血清，根據(jù)對(duì)應(yīng)的商品化ELISA 試劑盒對(duì)血清中IL-1β、IL-6、TGF-β1 和 TNF-α 含量進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 TUNEL 檢測(cè)大鼠海馬組織凋亡變化 末次給藥結(jié)束后，取大鼠海馬組織于4%多聚甲醛中固定48 h，組織脫水，石蠟包埋并切片，切片脫蠟后加蛋白酶K 工作液孵育20 min，再用PBS 洗滌后加入TUNEL 反應(yīng)液室溫避光孵育60 min，加DAPI 染核后封片，光學(xué)顯微鏡下拍照采集圖像，隨機(jī)選擇3個(gè)不同的視野分別計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)。

1.2.5 qPCR 法檢測(cè)大鼠海馬組織中HMGB1、TLR4 和 NF-κB 的 mRNA 表達(dá) 設(shè)計(jì)并合成大鼠HMGB1、TLR4、NF-κB 及 GAPDH 基因的 qPCR 檢測(cè)引物（表1）。取大鼠海馬組織，按照TRIzol 試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟提取樣本總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。qPCR 實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)總體積為20 μl，包含10 μl的實(shí)時(shí)PCR預(yù)混液，左右引物各0.8 μl，7.4 μl的超純水和1.0 μl的模板。采用3 步法進(jìn)行qPCR，具體如下：預(yù)變性95℃ 30 s，隨后40 個(gè)循環(huán)包括變性 95℃ 5 s，60℃ 退火 20 s 及延伸72℃ 20 s，每個(gè)樣品做 3 次重復(fù)檢測(cè)。采用 2-ΔΔCt法分析目的基因的相對(duì)表達(dá)情況。

表1 大鼠HMGB1、TLR4、NF-κB及GAPDH基因引物Tab.1 Rat HMGB1，TLR4，NF-κB and GAPDH gene primer

1.2.6 免疫組化檢測(cè)大鼠海馬組織中HMGB1、TLR4和NF-κB的表達(dá) 末次給藥結(jié)束后，取完整大鼠海馬組織以4%的多聚甲醛固定，經(jīng)過(guò)逐步脫水，石蠟包埋切片。組織切片脫蠟后用枸櫞酸鈉緩沖溶液行抗原修復(fù)，隨后用3% H2O2溶液清除切片內(nèi)源性過(guò)氧化酶，接著山羊血清溶液封片，加入一抗后4℃過(guò)夜，隨后滴加HRP 標(biāo)記的二抗并于室溫下孵育 20 min 后，PBS 洗滌，再進(jìn)行 DAB 顯色、蘇木精復(fù)染及1%鹽酸酒精分化，自來(lái)水沖洗切片后通過(guò)酒精脫水及二甲苯透明后中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，通過(guò)Image J軟件來(lái)分析所采集圖片的平均光密度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 SPSS17.0 軟件行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)使用表示，數(shù)據(jù)多組間比較通過(guò)單因素方差分析，組間多重比較使用LSD-t法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠海馬組織病理變化 HE 染色結(jié)果如圖1所示，假手術(shù)組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)清晰完整，細(xì)胞形態(tài)完好呈圓形、橢圓形，分布有序，形態(tài)正常。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠細(xì)胞排列雜亂，細(xì)胞間距增加，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、破裂、輪廓模糊；相對(duì)于模型組，卡馬西平組大鼠細(xì)胞分布尚且整齊，細(xì)胞形態(tài)也較為正常，存在少量破裂、壞死性神經(jīng)元細(xì)胞；相對(duì)于卡馬西平組，聯(lián)合給藥組大鼠細(xì)胞排列較整齊，細(xì)胞核形態(tài)較為正常，僅有散在的輪廓模糊、壞死的神經(jīng)元細(xì)胞。

圖1 HE染色觀察大鼠海馬組織病理變化（×200）Fig.1 HE staining to observe pathological changes of hip?pocampus（×200）

2.2 大鼠血清中 IL-1β、IL-6、TGF-β1 和 TNF-α 含量變化 大鼠血清中IL-1β、IL-6、TGF-β1 和TNF-α含量見(jiàn)表2。與假手術(shù)組相比，難治性癲癇模型大鼠血清中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α 含量顯著上升（P＜0.05），抗炎因子TGF-β1 表達(dá)顯著下降（P＜0.05）；與模型組相比，卡馬西平組及聯(lián)合給藥組大鼠血清中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α 表達(dá)顯著上升（P＜0.05），抗炎因子TGF-β1 表達(dá)顯著下降（P＜0.05）；與卡馬西平組相比，聯(lián)合給藥組大鼠血清中炎癥因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 表達(dá)下降，抗炎因子TGF-β1表達(dá)顯著上升（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TGF-β1和TNF-α含量變化（，n=6，pg/ml）Tab.2 Changes of IL-1β，IL-6，TGF-β1 and TNF-α contents in rat serum of each group（，n=6，pg/ml）

表2 各組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TGF-β1和TNF-α含量變化（，n=6，pg/ml）Tab.2 Changes of IL-1β，IL-6，TGF-β1 and TNF-α contents in rat serum of each group（，n=6，pg/ml）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with CBZ group，3）P＜0.05.

TNF-α 313.17±35.8 869.67±73.041）599.27±64.831）2）456.37±46.061）2）3）Groups Sham operation Model CBZ PGZX+CBZ IL-1β 25.13±3.4 83.79±12.361）63.60±9.461）2）44.37±6.61）2）3）IL-6 48.45±7.76 122.35±18.131）88.49±12.88 1）2）73.53±7.911）2）TGF-β1 510±68.53 284.33±32.081）375.67±31.891）2）466±43.862）3）

2.3 各組海馬組織中細(xì)胞凋亡情況 大鼠海馬組織凋亡變化見(jiàn)圖2。和假手術(shù)組相比，難治性癲癇模型大鼠海馬組織的凋亡增加（P＜0.05）；和模型組相比，卡馬西平組及聯(lián)合給藥組大鼠海馬組織的凋亡下降（P＜0.05）；和卡馬西平組相比，聯(lián)合給藥組大鼠海馬組織的凋亡下降（P＜0.05）。

圖2 大鼠海馬組織凋亡（×400）Fig.2 Apoptosis of hippocampus in rats（×400）

2.4 各組大鼠海馬組織中HMGB1、TLR4 和NF-κB的mRNA 變化 大鼠海馬組織中HMGB1、TLR4 和NF-κB的mRNA表達(dá)見(jiàn)圖3。與假手術(shù)組相比，難治性癲癇模型大鼠海馬組織中HMGB1、TLR4 和NF-κB 表達(dá)量明顯上升（P＜0.05）；與模型組相比，卡馬西平組及聯(lián)合給藥組大鼠海馬組織中HMGB1、TLR4 和NF-κB 表達(dá)顯著下降（P＜0.05）；與卡馬西平組相比，聯(lián)合給藥組大鼠海馬組織中HMGB1、TLR4和NF-κB表達(dá)顯著下降（P＜0.05）。

圖3 大鼠海馬組織中 HMGB1、TLR4 和 NF-κB 的mRNA表達(dá)Fig.3 Expressions of HMGB1，TLR4 and NF-κB mRNA in rat hippocampus

2.5 IHC 檢測(cè)大鼠海馬組織中 HMGB1、TLR4 和NF-κB 的變化 各組大鼠海馬組織中HMGB1、TLR4 和NF-κB 的蛋白變化見(jiàn)圖4~6。與假手術(shù)組相比，難治性癲癇模型大鼠海馬組織中HMGB1、TLR4 和 NF-κB 表達(dá)增加；與模型組相比，卡馬西平組及聯(lián)合給藥組大鼠海馬組織中HMGB1、TLR4 和NF-κB表達(dá)下降；與卡馬西平組相比，聯(lián)合給藥組大鼠海馬組織中HMGB1、TLR4和NF-κB表達(dá)下降。

圖4 大鼠海馬組織HMGB1變化（×400）Fig.4 Changes of HMGB1 expression in rat hippocampus（×400）

圖5 大鼠海馬組織TLR4變化（×400）Fig.5 Changes of TLR4 expression in rat hippocampus（×400）

圖6 大鼠海馬組織NF-κB變化（×400）Fig.6 Changes of NF-κB expression in rat hippocampus（×400）

3 討論

在我國(guó)癲癇于《馬王堆帛書(shū)五十二病方》中首次記載，唐代孫思邈的《千金方》則首次把癇癥稱(chēng)之為癲癇。中醫(yī)藥學(xué)認(rèn)為癲癇是一類(lèi)反復(fù)發(fā)作的神志異常性疾病，其病因?yàn)楦物L(fēng)內(nèi)動(dòng)、痰隨風(fēng)動(dòng)、風(fēng)痰上擾、心神被蒙［14］。平肝止癇復(fù)方的成分契合癲癇疾病的肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)中醫(yī)學(xué)思路的闡述，復(fù)方以天麻為君藥，全蟲(chóng)、膽星和郁金為臣藥，水劍草為佐使藥。天麻息風(fēng)止痙及平抑肝陽(yáng)，全蟲(chóng)祛風(fēng)止痙，郁金行氣化瘀、清心解郁，膽星息風(fēng)定驚，水劍草開(kāi)竅豁痰、鎮(zhèn)驚定癇。經(jīng)典的抗癲癇藥物卡馬西平其主要作用于癲癇復(fù)雜部分性發(fā)作，亦稱(chēng)精神運(yùn)動(dòng)性發(fā)作或顳葉癲癇，為臨床常見(jiàn)難治性癲癇類(lèi)型。因其抗癲癇效果肯定，價(jià)格低廉，目前仍是抗癲癇一線用藥，符合我國(guó)國(guó)情，更符合西南等落后地區(qū)。我們前期研究也表明相比于平肝止癇復(fù)方單獨(dú)用藥，平肝止癇復(fù)方聯(lián)合卡馬西平對(duì)難治性癲癇有著較好的療效［15］。炎癥在癲癇疾病的產(chǎn)生和發(fā)展中都起著極為重要的作用。癲癇的反復(fù)性發(fā)作能夠?qū)е履X內(nèi)炎癥反應(yīng)，造成腦內(nèi)如海馬等癲癇敏感腦區(qū)組織的病理改變。因此探究炎癥反應(yīng)在癲癇疾病中的機(jī)理可以為其診治帶來(lái)新的思路。目前已有研究比較了臨床上確診的難治性癲癇患者和正常人的大腦中HMGB1 和NF-κB 的蛋白含量，證明了HMGB1和NF-κB通過(guò)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，影響難治性癲癇的診治［16］。NASS 等［17］研究也證明癲癇發(fā)作后，HMGB1 和一些免疫因子發(fā)生了階段性變化。本研究在此基礎(chǔ)上，以平肝止癇復(fù)方聯(lián)合卡馬西平干預(yù)癲癇大鼠，研究其治療效果并探索其機(jī)制。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)相比于假手術(shù)組，難治性癲癇模型大鼠海馬組織中細(xì)胞輪廓模糊、排列紊亂，細(xì)胞的凋亡率增加，另外大鼠血清炎癥相關(guān)因子IL-1β、IL-6和TNF-α 表達(dá)量也顯著性增加，抗炎相關(guān)因子TGF-β1 表達(dá)量顯著降低，說(shuō)明癲癇能誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元的炎癥反應(yīng)，加劇神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。目前也有研究表明癲癇的發(fā)作可激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，其通過(guò)介導(dǎo)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)導(dǎo)致神經(jīng)炎癥的持續(xù)性發(fā)生，同時(shí)炎癥反應(yīng)能夠使癲癇發(fā)作的閾值下降并增加癲癇發(fā)作的頻率，引起海馬神經(jīng)元細(xì)胞的損傷［18-20］。通過(guò)給予卡馬西平或聯(lián)合用藥治療后，發(fā)現(xiàn)相比于模型組大鼠，各給藥組中癲癇大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡率下降，血清中IL-1β、IL-6和TNF-α 含量也均降低，TGF-β1含量顯著性上升，其中聯(lián)合給藥組變化趨勢(shì)最明顯，說(shuō)明平肝止癇復(fù)方聯(lián)合卡馬西平可清除機(jī)體過(guò)多的炎癥因子，進(jìn)而緩解神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，該中西藥聯(lián)用具有協(xié)同增效的作用效果。

HMGB1 是一種高度保守的核DNA 結(jié)合蛋白。在細(xì)胞核中，HMGB1 作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。同時(shí)HMGB1 也是損傷相關(guān)模式分子家族的主要成員之一，其可從免疫細(xì)胞自主分泌或從損傷的細(xì)胞被動(dòng)轉(zhuǎn)移到胞漿或胞外，通過(guò)作用于細(xì)胞膜上RAGE 受體和Toll 樣受體如TLR4 的活化完成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，這些活化的受體進(jìn)而引發(fā)NF-κB 的活化，從而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)［21-23］。近年來(lái)研究也顯示HMGB1/TLR4/NF-κB 信號(hào)通路參與了炎癥介導(dǎo)的癲癇［24-26］。WALKER 等［27］認(rèn)為 HMGB1/TLR4 通路的異常激活可以促進(jìn)癲癇的發(fā)生，HMGB1可作為癲癇發(fā)生的標(biāo)志物之一。FU 等［28］研究也表明通過(guò)降低癲癇小鼠腦組織中HMGB1 含量能夠減少炎癥因子的表達(dá)，抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。本研究結(jié)果表明與假手術(shù)組大鼠對(duì)比，難治性癲癇大鼠模型組海馬組織中 HMGB1、TLR4、NF-κB 的 mRNA 及蛋白表達(dá)量顯著上升。與模型組相比，各給藥組大鼠海馬組織中 HMGB1、TLR4、NF-κB 的 mRNA 及蛋白表達(dá)量顯著下降，其中聯(lián)合給藥組下降趨勢(shì)最明顯，表明平肝止癇復(fù)方聯(lián)合卡馬西平可能通過(guò)HMGB1/TLR4/NF-κB 信號(hào)通路調(diào)控體內(nèi)的炎癥反應(yīng)而控制癲癇的發(fā)作。

綜上所述，平肝止癇復(fù)方聯(lián)合卡馬西平對(duì)難治性癲癇大鼠有較好的效果，分子機(jī)制可能是通過(guò)抑制HMGB1/TLR4/NF-κB 信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)從而控制癲癇的發(fā)作。