過敏毒素C5a在痛風性關節炎患者中的表達及意義

劉 靜 羅釆南 王 丹 陳 勇 袁佳利 羅雄燕 （川北醫學院附屬醫院，南充 637000）

痛風性關節炎（gouty arthritis，GA）是一種最常見的晶體沉積性關節炎，主要由超飽和度的尿酸鹽在關節內和關節周圍組織中沉積所引起。尿酸鹽在關節和關節周圍沉積導致大量中性粒細胞滲入關節組織，吞噬尿酸鹽結晶后釋放大量炎癥介質，繼而造成關節紅腫熱痛。過敏毒素C5a是補體成分5（the fifth component of complement，C5）在被激活過程中形成的活性片段，在炎癥過程尤其是在趨化中性粒細胞遷移到炎癥部位過程中發揮極為重要的作用［1］，但 C5a 是否與 GA 中大量中性粒細胞在受累關節的聚集有關，目前報道較少。本文通過檢測急性GA患者血清和關節液中的C5a濃度，并分析其與臨床和實驗室指標的相關性，旨在探討C5a在GA發生中的作用。

1 資料與方法

1.1 資料 納入 2019 年 2 月至 2019 年 11 月在川北醫學院附屬醫院、四川大學華西醫院和新疆維吾爾自治區人民醫院風濕免疫科確診為GA 的患者37 例，其中男 36 例，女 1 例，年齡 16~65 歲，平均40.4 歲；從GA 首次發作到本次就診時的病程為1 d~75 個月，平均18.4 個月。本次發作后到就診時的時間間隔為1~9 d，平均2.7 d。所有患者均符合2015 年美國風濕病學會（ACR）/歐洲抗風濕病聯盟（EULAR）痛風分類標準［2］。納入28 例膝骨關節炎（osteoarthris，OA）作為疾病對照組，其中男19 例，女9 例，年齡 46~63 歲，平均 51.2 歲，均符合 2010 年EULAR 膝OA 的診斷分類標準［3］。詳細收集所有患者的臨床資料，包括癥狀、體征、實驗室檢查結果以及檢查前的藥物治療情況。另納入30例年齡、性別匹配的健康體檢者作為正常對照組。

1.2 方法

1.2.1 GA 受累關節評估 對GA 受累關節的疼痛評分采用視覺模擬尺（VAS）進行自我評價；參照文獻［4］方法對患者進行關節壓痛評分及關節腫脹評分。

1.2.2 關節液尿酸鹽晶體檢查 21 例GA 和20 例OA 患者行膝關節穿刺術，在無菌條件下以膝關節髕骨上緣為穿刺點，進針后抽取關節液，取部分送檢常規化驗、細菌學檢查和尿酸鹽晶體檢測，剩余部分1 000 g 離心15 min，收集上清液置-30℃保存備用。尿酸鹽晶體檢查：取20 μl新鮮關節液滴加到載玻片上，蓋上蓋玻片后置偏振光顯微鏡（上海締倫光學儀器有限公司）下觀察，在10×40高倍視野下隨機取10 個視野，對雙折光針狀晶體計數，取平均值。

1.2.3 C5a 檢測 分別抽取上述患者及對照者空腹靜脈血2 ml，4℃靜置30 min，待血凝后1 000 g離心15 min，收集血清于-30℃保存備用。C5a 的檢測采用酶聯免疫吸附法（ELISA），操作按試劑盒［北京義翹神州科技有限公司（KIT10604）］說明書中的步驟進行。待測樣本（血清和關節液）按1∶2 稀釋，根據標準品的OD 值繪制曲線，并據此計算所測樣本的C5a濃度。

1.2.4 C5a 體外誘發試驗 按文獻報道的方法配制尿酸單鈉晶體懸液［5］，簡要步驟如下：取 0.5 g 尿酸（Sigma 公司）加入到100 ml 的12%NaOH 溶液中，磁棒攪勻后用鹽酸調整pH 為7.2，于120℃烤箱中放置6 h，取出冷卻至室溫，偏振光顯微鏡下觀察晶體形成情況后置4℃保存備用。取健康對照者的新鮮血清，加入尿酸單鈉晶體懸液，分別至尿酸終濃度為0.01、0.1、1 mg/ml，對照組加等體積的PBS 溶液，37℃ 孵育10 min，取100 μl上述溶液ELISA方法檢測C5a濃度。

1.3 統計學分析 所有數據采用SPSS23.0軟件包進行分析。組間比較采用t檢驗或秩和檢驗，相關性采用 Pearson 或 Spearman 分析，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 GA 患者血清和關節液中C5a 濃度升高 GA患者血清C5a 濃度（34.7±19.1）ng/ml 明顯高于健康對照組（17.0±6.7）ng/ml（t=5.24，P=0.000）和OA患者（Z=-3.91，P=0.000），見圖1，GA患者關節液中C5a濃度為（43.3±23.3）ng/ml，顯著高于配對血清中 C5a 濃度（36.1±20.6）ng/ml（t=-2.47，P=0.023）和 OA 患者關節液中 C5a 濃度（24.5±12.0）ng/ml（t=3.27，P=0.003），而C5a濃度在OA患者的血清和關節液中差異無顯著統計學意義（t=0.11，P=0.912）。

圖1 健康對照組（HC）、痛風性關節炎（GA）和骨關節炎（OA）血清和關節液中C5a濃度檢測結果Fig.1 C5a concentration in serum and synovial fluid of healthy control group（HC），gouty arthritis（GA）and osteoarthritis（OA）

2.2 C5a 濃度與臨床指標的相關性分析 GA 患者C5a 濃度與臨床癥狀和實驗室指標見表1，血清C5a濃度與患者疼痛程度無明顯相關性聯系（r=0.11，P=0.622，圖2A），但與受累關節的壓痛（r=0.49，P=0.023，圖2B）和腫脹（r=0.57，P=0.007，圖2C）程度呈顯著正相關。

表1 GA患者C5a濃度與臨床癥狀和實驗室指標相關性分析Tab.1 Correlation analysis of GA patients' C5a concen?tration with clinical symptoms and laboratory indi?cators

圖2 GA患者血清C5a濃度與臨床指標的相關性分析Fig.2 Correlation analysis of GA patients' serum C5a concentration with clinical symptoms

2.3 C5a 濃度與實驗室指標的相關性分析 血清C5a 濃度與血尿酸濃度（r=0.09，P=0.592，圖3A）、WBC 計數（r=0.31，P=0.063，圖3B）呈現正相關趨勢，但均無統計學意義，僅與CRP 濃度存在相關性聯系（r=0.37，P=0.024，圖3C）。而關節液中C5a 濃度則與關節液WBC 計數呈現顯著相關（r=0.55，P=0.009，圖4A）。雖然血尿酸濃度與血清C5a 濃度不存在統計學意義的相關性，但關節液中尿酸鹽晶體負荷與關節液C5a濃度密切相關（r=0.47，P=0.033，圖4B）。

圖3 GA患者血清C5a濃度與實驗室結果的相關性分析Fig.3 Correlation analysis between C5a concentration of serum and laboratory results in GA patients

圖4 GA患者關節液C5a濃度與實驗室結果的相關性分析Fig.4 Correlation analysis between C5a concentration of synovial fluid and laboratory results in GA patients

2.4 體外尿酸單鈉晶體誘導C5a 生成 鑒于觀察到血尿酸濃度與血清C5a 濃度無關，而關節液中尿酸鹽晶體數量與關節液C5a 濃度密切相關，提示尿酸鹽晶體可能刺激C5a的生成，為驗證這一可能性，在體外對尿酸單鈉晶體誘導C5a生成的情況進行了研究，結果顯示：尿酸單鈉晶體以劑量依賴性方式促進C5a生成（表2、圖5）。

表2 MSU體外誘導C5a生成Tab.2 C5a induced by MSU in vitro

圖5 體外尿酸單鈉晶體對C5a生成的影響（n=9）Fig.5 Effect of monosodium urate crystals on C5a pro?duction in vitro（n=9）

3 討論

補體C5 是補體系統中的重要組分，由a、b 兩條多態鏈通過二硫鏈相連組成，分子量190 kD，在補體激活過程中，經C5 轉化酶作用后裂解成115 kD的 C5a 和 75 kD 的 C5b 兩個活性片段。C5a 在炎癥過程中的作用已被大量研究證實，類風濕關節炎、銀屑病關節炎等炎性關節疾病均發現有C5a濃度增高，C5a 可促進炎癥細胞在關節液的滲出，以中性粒細胞更甚［1，6］。雖然臨床觀察到，GA 的關節液中中性粒細胞數升高較類風濕關節炎和銀屑病關節炎更明顯，但目前有關C5a在GA發生中的作用報道較少，為此本研究對GA 患者進行了C5a 濃度的檢測，并對其臨床和實驗室指標進行了分析，結果顯示：GA 患者血清C5a 濃度明顯高于健康對照組（P=0.000）和OA 患者（P=0.000），而且增高的C5a 濃度與關節壓痛指數（r=0.49，P=0.023）、關節腫脹指數（r=0.57，P=0.007）和炎性反應指標 CRP（r=0.37，P=0.024）存在顯著的正相關，提示血清C5a 濃度可以作為判斷 GA 炎癥程度的指標。DOHERTY 等［7］和 BRODEUR 等［8］分別在 GA 患者關節液中檢測到補體成分3（C3）、補體成分4（C4）和C5 的活性片段C3a、C3d、C4d 及 C5b-9，加之本文檢測到的C5a，說明補體系統參與GA的發生過程。

對關節液C5a濃度進行分析，結果顯示GA患者關節液C5a 濃度高于血清濃度（P=0.023），表明C5a可在炎性關節內產生。進一步的分析發現，GA 患者關節液C5a 濃度與關節液WBC 計數呈現顯著正相關，證實C5a 在趨化WBC 浸入關節部位中發揮重要作用。值得注意的是，雖然本文觀察到GA 患者血尿酸濃度與血清C5a 濃度并無相關性聯系（r=0.09，P=0.592），但GA 患者關節液中尿酸鹽晶體量則與關節液C5a 濃度呈現顯著正相關（r=0.47，P=0.033），結合GA患者關節液C5a濃度高于血清中濃度這一現象，推測尿酸鹽晶體而不是可溶性尿酸可促進C5a 的生成。為驗證這一可能，在體外對尿酸單鈉晶體誘導C5a 生成情況進行研究，結果證實尿酸單鈉晶體可以以劑量依賴性方式促進C5a 生成。RUSSELL 等［9］的研究證實，尿酸單鈉晶體誘導 C5a生成與尿酸單鈉晶體表面有C5轉化酶形成有關。

BROVOLD 等［10］觀察到只有尿酸鹽晶體而不是可溶性尿酸可刺激單核細胞表達TNF-α、IL-1β、MCP-1 和IL-8，表明尿酸鹽結晶而非尿酸是促炎癥反應的元兇，臨床觀察證實GA 由尿酸鹽晶體在關節部位的沉積所誘發，本文也在GA 關節內發現有大量尿酸鹽晶體存在。近幾年對GA 的分子病理機制研究證實，尿酸鹽晶體通過激活NLRP3 炎癥體，進而將IL-1β 前體轉化成活性IL-1β，由此促發炎癥反 應［11］。 但 BAUERNFEIND 等［12］和 KHAMENEH等［13］的研究結果表明，尿酸鹽晶體單獨并不能激活NLRP3 炎癥體，只有當單核細胞/巨噬細胞預先暴露在細菌脂多糖、穿孔毒素及致炎細胞狀況下，尿酸鹽晶體才能激活 NLRP3 炎癥體。AN 等［14］發現，單核細胞用C5a預處理后加入尿酸單鈉晶體可引起NLRP3 炎癥體的激活，導致大量 IL-1β 產生，C5a 拮抗劑可阻斷這一作用。KHAMENEH 等［13］在尿酸單鈉晶體誘導的鼠腹膜炎巨噬細胞中也觀察到C5a的這一作用。CUMPELIK 等［15］在尿酸單鈉晶體誘導的鼠腹膜炎中進一步發現，雖然C5aR+/+小鼠和C5aR-/-小鼠在注射尿酸單鈉晶體后均有大量C5a 的生成，但僅在C5aR+/+小鼠觀察到NLRP3炎癥體的激活，并伴隨大量IL-1β產生，提示C5a通過與其受體結合促進尿酸鹽晶體激活NLRP3 炎癥體。這些結果表明，C5a在尿酸鹽晶體誘導的NLRP3炎癥體激活中發揮至關重要的作用［16］，由此也可以解釋本文觀察到的C5a濃度與GA炎癥程度相關這一現象。

綜上所述，尿酸鹽晶體可誘發C5a的生成，而增高的C5a濃度與GA患者關節壓痛指數、關節腫脹指數、炎癥反應指標CRP、關節液WBC 計數存在顯著的正相關性，表明血清C5a濃度可以作為判斷GA炎癥程度的指標。