Treg/ Th17平衡與膿毒癥的關系研究進展①

張改君 龍細雨 靳露露 賈建偉 郭麗穎 （天津中醫藥大學，天津301600）

調節性T 細胞（T regulatory cell，Treg）和輔助性T 細胞17（helper T cells Th17，Th17）同屬于 CD4+T細胞亞群，但兩者在免疫調節中發揮不同作用。Treg 可分泌抑制炎癥的細胞因子如IL-10、TGF-β等，發揮免疫抑制作用；Th17 細胞可分泌促炎因子如IL-17、IL-21、IL-22 等，促進炎癥進展。Treg/Th17平衡在維持免疫耐受中發揮重要作用。研究證實，Treg/Th17 失衡與自身免疫性疾病、腫瘤、炎癥等疾病關系密切［1-3］。此外，Treg/Th17 平衡在膿毒癥發生、發展及預后中具有重要調節作用。中藥具有多成分、多靶點、副作用小等優勢，通過調節Treg/Th17平衡在膿毒癥治療中具有重要參考意義。

1 Treg/Th17概述

1.1 Treg 分化 Treg 是 CD4+T 細胞亞型，主要在胸腺中產生，也可由外周誘導分化形成［4］。胸腺中nTreg在自身抗原、細胞因子和胸腺共刺激分子刺激下發育；外周pTreg在外周TGF-β作用下從幼稚T細胞分化而來。除CD4 和CD25 外，Treg 特異表達轉錄因子Foxp3，且Foxp3對Treg生成不可或缺。無論是性聯免疫失調綜合征（IPEX）患者，Foxp3 功能缺失型基因突變小鼠scurfy，還是Foxp3 基因敲除小鼠，均證實Foxp3 缺失可導致nTreg 細胞生成障礙，從而使其他免疫細胞尤其是不表達Foxp3 的效應CD4+T 細胞即CD4+CD25-T 細胞功能過強，導致消耗綜合征或免疫細胞增生性自身免疫病［5-6］。如通過逆轉錄病毒使CD4+CD25-T 細胞高表達Foxp3，可導致部分效應CD4+T 細胞轉化為具有抑制功能的Treg。此外，nTreg 細胞分化受T 細胞（抗原）受體（T cell receptor，TCR）信號影響，信號越強，持續時間越長，nTreg 細胞數越多［7］。初始 T 細胞可在外周經細胞因子誘導表達 Foxp3，向 iTreg 細胞分化［8］。如TGF-β 是iTreg 分化的關鍵細胞因子，可通過Smad2/Samd3 磷酸化誘導Foxp3 表達，促進iTreg增殖［9］。

Treg 可產生抗炎因子、耗盡關鍵生長因子調節炎癥通路，發揮抗炎作用，維持自身免疫穩態。Treg產生IL-10和TGF-β等抗炎因子，也可通過細胞接觸依賴方式分泌抗炎因子，抑制炎癥進展［10-11］。臨床和動物實驗均表明，Treg 可增加 IL-10、IL-4、TGF-β和 IL-2 表達，降低促炎因子 IL-17 和 IFN-γ 水平［12］。活化的肝星狀細胞通過細胞接觸依賴方式促進Treg增殖，增強Treg 抑制活性，可明顯減輕肝臟炎癥和損 傷［13］。 Treg 也 可 通 過 CTLA-4 接 觸 依 賴 下 調CD80/CD86 表達，調節樹突狀細胞表型和功能，發揮免疫抑制作用［14］。Treg 需依賴關鍵因子如IL-2等，促進CD4+T 細胞向Treg 分化，發揮免疫耐受作用［15］。研究發現，阻斷 IL-2 可顯著提高小鼠 IFN-γ和 IL-17A 表達，缺失 IL-2 可顯著減少 Treg 數［16］。體外和體內實驗發現，缺乏持續的IL-2 信號刺激可減弱 Treg 的抑制功能［17］。調節炎癥通路也是 Treg 維持自身穩態的重要機制。研究報道，Treg 可通過調節 NF-kB 通路維持自身穩態［18］。此外，Treg 可通過抑制TLR4/NF-κB 信號通路激活減輕蛛網膜下腔出血引發的腦炎［19］。

1.2 Th17 細胞分化 Th17 細胞是 CD4+T 細胞的另一個亞型，主要分泌促炎因子IL-17、IL-21、IL-22等，在炎癥進展中起重要作用［20-22］。TGF-β 在炎癥細胞因子（如IL-6或IL-21）刺激下，通過維甲酸受體相關孤核受體 γt（retinoic acid receptor-related orphan receptor γt，RORγt）途徑參與Th17 細胞分化過程［23］。RORγt 是Th17 細胞分化和發揮功能必要的轉錄因子。體外在IL-6和TGF-β極化條件下刺激野生型或RORγt缺陷小鼠來源的CD4+CD25-CD62L+CD44-T細胞實驗發現，野生型CD4+T 細胞IL-17 產生明顯增加，而Rorγ-/-小鼠（缺乏Rorγ和Rorγt）CD4+T細胞在體外極化后 IL-17 細胞顯著減少［24］。RORγt 在促進Th17 細胞分化同時，抑制T 細胞分泌IL-10，導致Th17 細胞致病性［25］。此外，TCR 與信號傳導與活化轉錄因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）在維持Th17 細胞致病性方面發揮重要作用［26］。

TGF-β 在誘導Th17 細胞分化方面發揮重要作用。TGF-β1 缺陷小鼠在所有組織部位的Th17 細胞顯著減少［27］。盡管 IL-21 通過 SMAD4 誘導 Th17 細胞分化，但其作用發揮依賴于TGF-β，T細胞和IL-21共培養，加入 TGF-β 藥物抑制劑，Th17 細胞無法形成［28］。此外，研究表明，IL-6和IL-23通過介導TGF-β誘導IL-23R mRNA 表達和Th17 細胞分化，而抗TGF-β 幾乎完全抑制 IL-23R mRNA 上調及 IL-6 和IL-23誘導的Th17細胞分化［29］。

1.3 Treg/Th17 分化平衡 Th17 細胞和 pTreg 均在TGF-β 信號作用下由初始CD4+T 細胞分化而來。Th17 細胞分泌促炎因子引發自身免疫和炎癥反應，Treg 可抑制這種情況，維持機體免疫穩態［30］。Treg/Th17 平衡與自身免疫性肝炎、腫瘤、膿毒癥等發生發展相關［31-33］。TGF-β在T細胞分化和發育、內環境穩態、免疫耐受中發揮重要調節作用［34］。TGF-β 既可調控Foxp3表達，也可影響RORγt表達。Foxp3是初始 T 細胞分化為 Treg 的重要調節因子，RORγt 對Th17 細胞分化起關鍵作用。Th17 細胞可介導炎癥反應，并在功能上對抗Treg。Th17細胞和iTreg從初始T 細胞分化取決于TGF-β 表達水平。低水平TGF-β、IL23 或 IL-6 誘導幼稚 T 細胞發育為 Th17 細胞［35］。組織微環境中高水平 TGF-β 可能導致 iTreg產生［36］。介導 IL-6 的 STAT3 可誘導 RORγt 表達，并在Th17 細胞分化中起作用；而介導IL-2 和IL-5 的STAT5 可直接結合 Foxp3 基因，誘導 Treg 發育和功能［37］。因此，初始 CD4+T 細胞在微環境中 TGF-β 和IL-6 同時存在時，可上調 RORγt 表達，向 Th17 細胞分化，在缺乏促炎因子如 IL-6 時，TGF-β 促進 CD4+T細胞分化為 Treg［31］。IL-2 和 IL-15 通過 STAT5 通路上調Foxp3 基因表達，誘導初始CD4+T 細胞向Treg分化［38］。低氧誘導因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）通過下調Foxp3 基因，一方面可抑制初始CD4+T 細胞向Treg 分化，另一方面通過STAT3 通路正向調控，使初始CD4+T 細胞向Th17 細胞方向分化。代謝性產物如維A 酸在TGF-β 作用下，上調Foxp3 表達，抑制 IL-6 表達，促進初始 CD4+T 細胞向Treg分化（圖1）。

圖1 Treg和Th17細胞分化與平衡Fig.1 Differentiation and balance of Treg and Th17 cell

1.4 Treg/Th17 相關通路 雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，感受氨基酸、營養物質、生長因子等改變，調節各種基本細胞過程，包括蛋白合成、生長、代謝、衰老、再生、自噬等［39］。研究表明，敲除 Raptor 可導致 mTOR 通路功能受損小鼠發生炎癥相關性疾病，被輸入的正常小鼠Treg 效果減輕或逆轉，而輸入Raptor 敲除小鼠Treg 則無效［40］。因此，mTOR 依賴于 Treg 的免疫抑制功能。AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinas，AMPK）是細胞能量傳感器，是調節機體能量的關鍵分子，可通過促進線粒體脂肪酸氧化和抑制乙酰輔酶A 羧化酶活性快速提供能量［41-42］。研究表明，肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）可通過AMPK調節Treg代謝和能量穩態，LKB1缺陷小鼠導致Treg數減少和功能喪失，導致自身免疫性疾病［43］。部分小分子蛋白也可調節Treg/Th17 平衡，如雌激素受體α（ERRα）可促進Th17細胞分化，敲除小鼠ERRα后，小鼠體內Th17細胞表達受抑制［44］。低膽固醇飲食可通過激活肝X 受體（liver X receptors，LXRs）調節膽固醇代謝改善 Th17/Treg 平衡［45］。LXRs 激動劑T0901317 可抑制 IL-17 有效轉錄，抑制 Th17 細胞增殖［46］。

2 Treg/Th17與膿毒血癥

2.1 膿毒血癥與Treg/Th17 失衡 膿毒癥是一種對宿主感染引起的免疫反應失調進而威脅生命的MODS［47］。膿毒癥的特點是早期出現全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），后期出現免疫抑制、消炎或以代償性抗炎反應綜合征（compensatory anti-inflammatory response syndrome，CARS）［48-49］。膿毒癥發生發展可能與免疫功能紊亂密切相關。膿毒癥早期和晚期，T 細胞在免疫功能抑制或免疫過激方面均發揮重要作用［50］。膿毒癥患者Th17/Treg 失衡與MODS 進展關系密切。Th17 細胞分泌IL-17，IL-17 可能通過阻止IL-10過度產生減少繼發性抗炎反應，從而改善嚴重膿毒癥。膿毒癥早期患者中，缺乏IL-17 可能加重膿毒血癥晚期階段免疫失衡［51］。嚴重膿毒癥患者中，激活的Foxp3+Treg 最初被炎癥刺激所淹沒，但疾病后期，Treg 具有顯著保護作用。Treg 缺失使晚期生存率惡化，由此可知，Foxp3+Treg 在嚴重膿毒癥后期發揮有益作用。表明，Treg 抑制能力不足以控制嚴重炎癥和早期死亡率，但卻是嚴重膿毒癥恢復的先決條件［52］。

2.2 中藥調控Treg/Th17 平衡 Th17 細胞主要通過分泌IL-17 和IL-6 引起炎癥反應，而Treg 則通過分泌TGF-β 和IL-10 發揮抗炎作用。研究表明，Th17/Treg 失衡與膿毒癥和各種炎癥性疾病有關［51，53-54］。因此，調節 Th17/Treg 平衡可能是治療膿毒癥的有效措施［33］。HOU 等［55］通過盲腸結扎穿刺法建立小鼠膿毒癥模型，發現小劑量和中劑量（100 mg/kg 和200 mg/kg）黃芪多糖處理可減少膿毒癥小鼠Th 細胞數，抑制Th2 細胞和Treg 極化，減輕膿毒癥小鼠腎損傷，而大劑量（400 mg/kg）黃芪多糖可過度逆轉Th/Treg 反應失調損傷器官。CHEN等［56］采用體外T 細胞分化實驗，觀察血必凈注射液對膿毒癥小鼠Treg和Th17細胞分化的影響，結果發現，地塞米松對照組膿毒癥小鼠存活率無顯著提高，而血必凈注射液可通過直接和間接增強Treg 功能，拮抗 TNF-α 和 IL-6，抑制 Th17 細胞分化和增殖，在促炎階段抑制炎癥進展，提高膿毒癥小鼠感染性休克存活率。LIU 等［57］實驗表明，膿毒癥小鼠外周血、脾臟和胰腺組織Th1、Th17 細胞明顯增多，Treg減少；而黃芩苷可能作用于RORγt受體，通過RhoAROCK途徑抑制Th1和Th17反應，促進Treg增殖，減少IFN-γ 和IL-17 炎癥因子釋放，減輕膿毒癥小鼠胰腺損傷。CHEN 等［58］發現，姜黃素可提高血漿IL-10水平，抑制膿毒癥小鼠血漿TNF-α和IL-6分泌，顯著減輕膿毒癥小鼠肺部和腎臟炎癥性損傷，可將膿毒癥小鼠存活率顯著提高至60%（對照組為20%），進一步實驗闡述姜黃素可能通過NF-κB 信號通路增強 Treg 功能，減少 TNF-α 和 IL-6 炎癥因子釋放，從而提高膿毒癥小鼠存活率。GAO 等［59］發現膿毒癥組小鼠出現充血、炎癥細胞浸潤、壞死和變性等改變，且脾臟CD3+CD4+T 細胞和CD3+CD8+T 細胞凋亡率提高，丹參酮Ⅱ-A 可作用于高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein，HMGB1）受體，降低血清 HMGB1 水平，降低脾臟 CD4、CD8+T 細胞比例，增加脾臟中Treg 數，改善膿毒癥小鼠器官損傷和生存率。綜上，中藥在調控Treg/Th17 平衡治療膿毒癥方面療效顯著，但具體機制尚未明確，需進一步研究。

3 小結

Treg 與Th17 細胞分化需要多種調節因子參與，其中Foxp3 在Treg 分化中起關鍵作用，IL-6 和IL-21是誘導CD4+T 細胞分化為Th17 細胞的重要調節因子。Treg/Th17 平衡在自身免疫性疾病、腫瘤、炎癥等疾病中發揮維持免疫耐受和免疫穩態作用。近年隨著人們對Treg/Th17 平衡與疾病關系的不斷深入，發現其與膿毒癥關系密切。盡管護理和醫療水平有大幅提高，膿毒癥在ICU 死亡原因中依居高不下，迫切需要探索其發病機制，制定有效治療措施［60］。中藥在調節Treg/Th17 平衡方面發揮重要作用。如氧化苦參堿可抑制Th17 細胞分化，促進Treg分化調節 Treg/Th17 平衡［61］。探討 Treg/Th17 平衡與膿毒癥的關系，可以明確膿毒癥發病機制，為臨床靶向治療提供方向，為膿毒癥早期診斷與治療提供新思路。目前，雖然開展了多個中藥調節Treg/Th17 平衡治療膿毒癥的研究，但深度不夠，仍需加大中藥治療膿毒癥療效和機制研究。