綠原酸抑制糖酵解及脂肪酸代謝調控M1型巨噬細胞極化①

藍春花 孟 玲 陳成英 藍 利 王新航 常升搏小吉 陸彩玲 李習藝 唐 深

（廣西醫科大學基礎醫學院，南寧530021）

綠原酸（chlorogenic acid，CGA）是一種含有咖啡酸和奎寧酸的多酚物質，存在于人類飲食的咖啡或綠茶中，它已被證明具有多種有益的生物學特性，包括抗菌作用、抗炎作用、抗氧化作用以及抗腫瘤活性［1-2］。已有文獻報道 CGA 通過 NF-κB 抑制前列腺素E 和環氧合酶-2 的合成，并通過抑制JNK/AP-1活化而發揮抗炎作用［3］。其抗炎作用通過抑制NF-κB的激活，降低TNF-α和IL-6的基因表達［4］。同時CGA也可以減輕肝、腎等多個器官的缺血或再灌注損傷。

炎癥是機體對損傷、感染和應激的先天免疫反應，它在促炎和抗炎細胞因子之間保持平衡［5］。過度促炎細胞因子的產生可能導致慢性炎癥性疾病的發展。慢性炎癥或過度炎癥反應與非酒精性脂肪性肝炎、心肌梗死、糖尿病、阿爾茨海默病、動脈粥樣硬化、感染性休克等有關［6-7］。巨噬細胞是主要的炎癥和免疫細胞，在非特異性和特異性免疫反應中起著重要作用［5］。由于微環境中細胞因子的平衡，巨噬細胞可以分化為不同的活化狀態，它被廣泛歸類為“經典激活”促炎M1 型巨噬細胞和“替代激活”抗炎M2型巨噬細胞［8］。而巨噬細胞在不同極化狀態的代謝方式各異，M1 型的CD36 mRNA 表達水平增加可提高細胞內游離脂肪酸和氧化型低密度脂蛋白的攝取，細胞內脂質水平高于M2型［9］。促炎M1 型巨噬細胞主要依賴無氧糖酵解和磷酸戊糖途徑為主要代謝方式，以便巨噬細胞應對高度增殖的細菌感染；而抗炎M2 型巨噬細胞則以氧化磷酸化和脂肪酸氧化為主［10］。研究發現，在ox-LDL 誘導的RAW264.7 細胞脂質積累的模型中，CGA 可激活SIRT1并調節膽固醇代謝相關因子ABCA1、SREBP2和 miR-33 的表達［11］。飲食補充 CGA 對 LPS 慢性輸注所致的大鼠肝損傷有肝保護作用，主要機制是CGA 參與下調肝臟中糖酵解酶的活性，上調了氧化磷酸化的酶的活性，導致能量代謝從糖酵解向線粒體氧化磷酸化的轉變［12］。文獻報道CGA 抑制NF-κB 或 JNK/AP-1 活化而發揮抗炎作用，但 CGA是否通過調節巨噬細胞糖酵解水平和脂肪酸代謝水平來調控巨噬細胞炎癥極化尚不完全清楚。在本研究中，以THP-1細胞（人急性單核細胞白血病細胞系）構建體外M1型巨噬細胞模型，探討了CGA 是否能通過調節巨噬細胞糖酵解水平和脂肪酸代謝水平，從而影響M1 型巨噬細胞極化相關標志物的表達，調控M1巨噬細胞的極化。

1 材料與方法

1.1 材料 人急性單核細胞白血病細胞系THP-1細胞（中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫）。綠原酸（chlorogenic acid，Sigma），佛波酯（phorbol myristate acetate，美國Sigma公司）；IFN-γ（北京Sino-Biological 公司）；青霉素、鏈霉素、LPS、糖酵解相關酶（HK、PK、LDH）試劑盒（索萊寶生物技術公司）；RPMI1640 培養液、胎牛血清（美國Gibco 公司）；RNA 逆轉錄相關試劑、TRIzo（l日本TaKaRa 公司）；SYBR?Green Master（美國Roche 公司）；引物由Invi‐trogen 公司合成；StepOne 熒光定量 PCR 儀、Multi‐skan Go 全波長多功能酶標儀、CO2細胞培養箱均為美國Thermo Fisher Scientific 產品。

1.2 方法

1.2.1 THP-1 細胞培養 THP-1 細胞培養于含10% 的胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 鏈霉素的RPMI1640 培養液中，37℃5%CO2培養箱中靜置培養。

1.2.2 THP-1 細胞分化及分組 THP-1 細胞以1.0×106個/孔接種于6 孔板，經100 nmo/lL PMA 刺激24 h 活化為M0 型巨噬細胞，在此基礎上將實驗分為3 組。對照組（M0 型巨噬細胞）、M1 型巨噬細胞組（用 10 ng/ml LPS 和 20 ng/ml IFN-γ 處理 M0 巨噬細胞48 h）、CGA 處理組（用 50 μg/ml、100 μg/ml CGA 分別與 10 ng/ml LPS、20 ng/ml IFN-γ 共處理48 h），將細胞置于37℃5%CO2培養箱中培養，分化為M1型巨噬細胞。

1.2.3 倒置顯微鏡觀察細胞形態和Image J 軟件進行細胞形態學分析和計數 細胞分組同1.2.2，各分組細胞極化完成后，倒置顯微鏡觀察各組的細胞形態學改變并攝取實驗組3張細胞密度相近的細胞圖片，通過Image J 軟件自動計數各組內3 張細胞圖片中的總細胞數和長梭形、不規則形細胞數，最終算出長梭形和不規則形細胞數占總細胞數的百分比。

1.2.4 實時熒光定量PCR 檢測M1 型巨噬細胞表面標志物IL-6、TNF-α、COX-2、CXCL-10 和脂肪酸代謝相關標志物氧化物PPAR-γ、SREBP-1的mRNA 水平 THP-1 細胞按 1.0×106個/孔接種于 6 孔板，同1.2.2 實驗分組處理THP-1 細胞。分化完成后，各組實驗孔用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗1次，每孔加入1 ml TRIzol 試劑，按照試劑說明書提取總mRNA，以 500 ng 為總 RNA 逆轉錄為 cDNA，95℃預變性10 min，（95℃ 變性30 s，60℃ 退火10 s）×40 個循環，以 β-actin 為內參，采用 2-ΔΔCt法計算相對基因表達量。引物見表1。

表1 引物名稱和序列Tab.1 Primer names and sequences

1.2.5 微量法試劑盒檢測巨噬細胞內糖酵解相關 酶活性 HK（PK、LDH）提取：THP-1 細胞以1.0×106個/孔接種于6 孔板，同1.2.2 實驗分組處理細胞，先棄掉上清，用PBS 洗2 次，每孔加入200 μl HK（PK、LDH）提取液，用無菌的細胞刮子將細胞收集于1.5 ml EP 管內，在冰浴條件下超聲裂解細胞，4℃8 000 g離心10 min，取上清置于冰上待測。

按照試劑說明步驟加入試劑和待測樣本：振蕩混勻，酶標儀在波長340 nm 測定各組20 s 時的吸光值 A1 和 320 s 后的吸光值 A2，計算 ΔA=A2-A1，根據公式計算各組HK 的活性；再在波長340 nm 測定各組20 s 時的吸光值A1 和200 s 后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2，根據公式計算各組PK 的活性；450 nm 波長下測定實驗組和對照組吸光度A，計算ΔA=測定管A-對照管A，根據公式計算LDH活性。

1.3 統計學處理 所有實驗數據均采用SPSS17.0統計軟件進行分析，結果以表示，獨立樣本t檢驗，單因素方差分析及LSD 兩兩比較，每組實驗獨立重復3次以上，P<0.05具有統計學差異。

2 結果

2.1 倒置顯微鏡觀察CGA 處理后巨噬細胞形態學改變 THP-1 細胞經PMA 刺激活化為M0 巨噬細胞，細胞逐漸扁平貼壁呈煎蛋樣，由光亮變成灰色，形態呈類圓形或不規則形；M0 巨噬細胞極化M1 型巨噬細胞后，細胞伸出偽足，呈梭形和不規則形；CGA 處理組與M1 型組相比，梭形細胞和不規則細胞占比減少，隨著CGA 濃度增加這種形態變化越明顯。細胞形態學變化結果提示CGA 處理后能抑制M1型巨噬細胞長梭形和偽足的形成（圖1）。

圖1 巨噬細胞分化形態學變化Fig.1 Morphological of macrophage polarization

2.2 CGA 對M1 型巨噬細胞極化相關基因TNF-α、IL-6、CXCL-10、COX-2 mRNA 表達水平的影響 M1型與 M0 型相比，TNF-α、IL-6、CXCL-10、COX-2 這4 種極化相關標志物mRNA 表達均升高（P<0.05）；加入 CGA 處理后，與 M1 型極化組相比，TNF-α、IL-6、CXCL-10、COX-2 mRNA 表達均降低，且差異具有統計學意義（P<0.05）。以上結果提示CGA 可降低M1 型巨噬細胞極化相關基因標志物mRNA 表達水平（圖2）。

圖2 CGA對M1型巨噬細胞極化相關基因mRNA表達影響Fig.2 Effects of CGA on gene mRNA expression of M1 macrophage

2.3 CGA 對 M1 巨 噬 細 胞 PPAR-γ、SREBP-1 的mRNA 表達水平的影響 M1 型與M0 型相比，PPAR-γ、SREBP-1 mRNA 表達升高；加入 CGA 處理后，與 M1 型極化組相比，PPAR-γ、SREBP-1 mRNA表達均降低，且差異具有統計學意義（P<0.05）。以上結果提示CGA 可降低M1 型巨噬細胞PPAR-γ、SREBP-1 mRNA的表達水平（圖3）。

圖3 CGA 對 M1 型 巨 噬 細 胞 PPAR-γ、SREBP-1 基 因mRNA表達影響Fig.3 Effects of CGA on expressions of PPAR-γ and SREBP-1 genes in mRNA M1 macrophages

2.4 CGA 對M1型巨噬細胞糖酵解相關酶HK、PK、LDH 活性的影響 M0 型誘導極化為 M1 型，HK、PK、LDH酶活性均增加（P<0.05），CGA處理組與M1型極化組相比，HK、PK、LDH 活性降低，差異具有統計學意義（P<0.05）。結果提示，CGA 可以降低M1型巨噬細胞的糖酵解水平（圖4）。

圖4 CGA對M1型巨噬細胞糖酵解相關酶活性的影響Fig.4 Effects of CGA on glycolytic enzyme activity in M1 macrophage

3 討論

巨噬細胞是組織中的天然免疫細胞，作為介導炎癥的主要吞噬細胞，負責清除機體損傷組織和細胞碎片以及入侵的病原體，并參與炎癥損傷后的組織修復。在炎癥急性期，“經典激活”促炎M1 型巨噬細胞誘導炎癥反應，通過釋放促炎介質，包括細胞因子、趨化因子、活性氧等，誘導激活多種抗菌機制，有助于殺滅病原體和維持正常炎癥反應［13］。研究表明CGA 具有抗炎作用，促進傷口愈合，減輕肝缺血再灌注所致的肝損傷。CGA 通過抑制NF-κB信號通路激活從而下調CCl4誘導的大鼠肝臟炎癥和纖維化模型中血清IL-1β、TNF-α 和IL-6細胞炎癥因子水平［14］。

在腎缺血再灌注損傷的小鼠模型中，炎癥介質因子表達量增加，巨噬細胞數量增加，CGA通過降低TLR-4 信號通路相關蛋白（NF-κB、TNF-α 和MCP-1）的mRNA 表達，減少巨噬細胞的數量，從而減輕炎癥反應［15］。本研究中CGA 處理組的梭形細胞和不規則細胞數量減少，類圓形細胞增多，細胞伸出偽足減少，M1 型巨噬細胞極化標志物IL-6、TNF-α、CXCL-10、COX-2的mRNA 表達量下降，表明CGA 能降低M1 型巨噬細胞促炎癥細胞因子的表達，并抑制M1 型巨噬細胞貼壁展開和偽足形成。文獻報道單獨LPS處理RAW 264.7細胞可顯著提高細胞IL-6、TNF-α 蛋白表達水平和細胞上清液中 IL-6、TNF-α濃度，而CGA 與LPS 共孵育時，則表現出明顯的降低［16］，與本研究結果相似。

巨噬細胞在極化時會顯著改變其代謝途徑，在LPS，Th1細胞因子或IL-12的刺激下，其代謝向無氧糖酵解途徑的轉變，LPS和IFN-γ會誘導巨噬細胞葡萄糖攝取，抑制脂肪酸攝取和氧化［17-19］。SREBPs 是調控脂肪酸和膽固醇生物合成的關鍵轉錄因子，LPS 和炎癥細胞因子可以誘導巨噬細胞的SREBP-1產生活性；相反，SREBP-1c 缺乏的小鼠巨噬細胞在LPS 刺激后 IL-1β 分泌降低［20-21］。過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）是屬于類固醇/甲狀腺激素受體超家族的核受體，調節脂質代謝相關基因的表達，PPAR-γ 可通過激活促進脂質攝取和脂肪生成的基因來調節脂肪酸的儲存。PPAR-γ 的過度表達可導致脂肪組織和肝臟中的脂質積累［22］。本研究結果顯示，由M0 型分化為M1 型巨噬細胞后，糖酵解HK、PK、LDH 活性均增加，脂肪酸合成相關基因PPAR-γ、SREBP-1 的 mRNA 水平增加，提示細胞內糖酵解和脂肪酸代謝增加。研究表明，CGA 通過AKTPH結構域激活AKT/GSK3β/FOXO1信號，過調節糖異生和糖酵解酶，如葡萄糖6-磷酸酶（G6P）和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PEPCK）的基因表達，在肝臟維持葡萄糖穩態中發揮作用。CGA 也可降低小鼠肝臟組織脂肪酸合成酶和PPAR-γ2 的基因表達水平來降低脂肪酸的合成，起到保護肝臟的作用［23-24］。本研究結果表明 CGA 可以降低 M1 型巨噬細胞 HK、PK、LDH 活性，下調 PPAR-γ、SREBP-1 的mRNA 表達水平，提示CGA 處理后M1 型巨噬細胞中糖酵解和脂肪酸水平被抑制。這可能是CGA 參與負調控M1型巨噬細胞炎癥極化的機制之一。

綜上所述，CGA 可能通過抑制糖酵解和脂肪酸代謝水平，降低M1 型巨噬細胞促炎癥細胞因子的mRNA表達，負調控M1型巨噬細胞炎癥極化。本研究為探索CGA 在巨噬細胞相關炎癥性疾病的免疫營養治療提供新思路。