miR-145-5p 通過靶向DUSP6 抑制LPS 誘導的血管內皮細胞氧化損傷和炎癥①

王鴻利 何 琴 劉 帆 袁 霞 張 勤

（四川省醫學科學院·四川省人民醫院老年內五科，成都610072）

動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥疾病，以內皮細胞（endothelial cells，EC）為初始靶點，導致內皮功能障礙從而引發炎癥［1-3］。有研究表明雙特異性磷酸酶 6（dual-specificity phosphatase 6，DUSP6）參與炎癥相關生理過程并促進炎癥反應，而抑制DUSP6 過表達是有效的消炎療法［4-6］。microRNA（miRNA）是一種內源性非編碼RNA，具有約22 個核苷酸，通過與mRNA 的3'非翻譯區（3'UTR）結合來抑制基因的翻譯或誘導mRNA 切割，從而調節基因表達［7］。miRNA 已被證明參與多種炎癥反應的調節并且部分RNA 可參與調節與動脈粥樣硬化的發生和發展有關的血管壁炎癥［8-10］。研究發現miR-145-5p 可通過多種途徑緩解體內炎癥反應，但其對動脈粥樣硬化發生過程的調節還未見報道［11-12］。脂多糖（lipo‐polysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要成分，可激活血管內皮細胞，引起白細胞滲透進入血管壁，并增加血管通透性，被認為是炎癥反應的有效誘導劑［13］。在本研究中，以LPS 誘導的人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）為炎癥損傷模型，探討了miR-145-5p對血管EC 氧化損傷和炎癥的調節作用及相關的分子機制，旨在為動脈粥樣硬化引起的EC 損傷治療提供新的依據。

1 材料與方法

1.1 材料 HUVECs 來自美國ATCC。LPS、高葡萄糖DMEM 培養基、胎牛血清均購自Sigma公司；鏈霉素和青霉素購自HyClone 公司；pcDNA、miR‐NC、pcDNA-DUSP6、miR-145-5p mimic、pMIR 報告質粒載體及試驗所用序列購自RiboBio 公司；Lipo‐fectamine2000 試劑購自Invitrogen 公司；試驗所用抗體均購自上海艾博抗生物科技有限公司；BCA 試劑盒，iNOS 檢測試劑盒和IL-10 檢測試劑盒購自合肥萊爾生物科技有限公司；反轉錄試劑盒購自TaKaRa公司；組織蛋白提取試劑盒購自Foregene公司；逆轉錄酶、TRIzol 試劑盒、熒光素酶檢測試劑盒購自Pro‐mega公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 HUVECs 細胞用含有10%胎牛血清的高糖培養基培養（含鏈霉素、青霉素雙抗），在37℃、5%CO2培養箱中培養至生長約80%后傳代，取4~5代生長狀態良好的細胞用于后續試驗。

1.2.2 細胞轉染及細胞模型建立 將HUVECs 細胞以 5×105個/ml 的密度接種于 12 孔板中培育至約80%匯合進行轉染，分別進行pcDNA、miR-NC、pcD‐NA-DUSP6、miR-145-5p mimic轉染和pcDNA-DUSP6與miR-145-5p mimic共轉染。將DUSP6 mRNA 的編碼區克隆到pcDNA3.1（+）載體中。所有細胞轉染程序均使用Lipofectamine2000進行。

1.2.3 體外細胞模型建立 轉染成功后收獲細胞，非Control組細胞進行LPS 誘導（2 h）以建立炎癥損傷模型。當天誘導試驗完成后吸去細胞培養基隨即加入新鮮的無血清DMEM 培養基后孵育12 h。實驗分組：Control 組、LPS 組、LPS+mimic 組、LPS+DUSP6 組和LPS+mimic+DUSP6 組。培養結束后分別收集5組細胞培養上清液置-80℃保存。

1.2.4 RT-PCR 檢測方法 TRIzol 試劑盒抽提總mRNA，使用逆轉錄酶先合成cDNA，然后再進行PCR 擴增，反應條件：94℃ 先變性 3 min，然后 94℃1 min，53℃ 1 min，72℃ 1 min，36 個循環，最后 72℃7 min。RT-PCR 產物經電泳后用計算機圖像分析儀掃描，經凝膠圖像分析系統，對產物的電泳條帶進行灰度分析，計算相對mRNA 水平表達量。引物序列miR-145-5p：F 5'-CAGTCTTGTCCAGTTTTCCCAG-3'；R 5'-TATGCTTGTTCTCGTCTCTGTGTGTC-3'。DUSP6：F 5'-CAGTGGTGCTCTACGACGAG-3'；R 5'-GCAATGCAGGGAGAACTCGGC-3'。

1.2.5 雙重熒光素酶實驗 TargetScan 軟件顯示DUSP6 是 miR-145-5p 的 靶 標 之 一 。 DUSP6 野 生 型（DUSP6-WT）片段（包含潛在的結合位點）和相應DUSP6 突變型（DUSP6-MUT）片段被插入miR-145-5p 的pMIR 報告質粒載體，以產生DUSP6 螢光素酶報告基因構建體。然后，使用Lipofectamine 2000 試劑將載體和miR-145-5p 模擬物共轉染到HUVECs細胞中［14］。轉染24 h 后，使用熒光素酶檢測試劑盒測定細胞。記錄Rluc/Luc。

1.2.6 試劑盒檢測氧化應激 細胞樣取上清液，按照SOD 檢測試劑盒和MDA 檢測試劑盒的操作要求進行實驗操作與結果分析。

1.2.7 ELISA 法檢測細胞上清液中炎癥因子 細胞樣取上清液，按照iNOS 檢測試劑盒和IL-10 檢測試劑盒的操作要求進行實驗操作與結果分析。

1.2.8 流式細胞術檢測細胞凋亡 每組細胞樣品各取一份，用AnnexinV/PI 雙染色流式細胞術檢測細胞凋亡，并計算細胞凋亡率。

1.2.9 Western blot 按照細胞蛋白提取試劑盒說明進行蛋白提取，用BCA 法測定蛋白濃度，將制備好的蛋白樣品加入10%的凝膠中電泳，轉膜，取膜，將其加入封閉液中，保持20 min，用蒸餾水將一步法試劑盒中的10×洗液稀釋成1×洗液；取二抗HRP 至4 ml 離心管中，再取一抗與二抗混勻，室溫孵育5 min，加入一步法抗體稀釋液。其中，一抗濃度Bax（1∶1 000），Bcl-2（1∶500），DUSP6（1∶1 000），一抗內參Actin濃度（1∶1 000），二抗內參Actin濃度（1∶500），去抗體混合液，用洗液漂洗3次，5 ml×5 min。ECL 顯色曝光，采用Image J 分析內參Actin 和目標條帶的灰度值，目標條帶蛋白水平=目標條帶的灰度值/Actin 的灰度值。每組實驗重復3 次，每次設3 個復孔。

1.3 統計學分析 采用SPSS21.0軟件分析實驗數據，實驗數據用表示，多組差異比較用單因素方差分析，組間比較用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-145-5p 靶 向 DUSP6 HUVECs 細 胞 轉 染pcDNA-DUSP6 后結果顯示，與 Control 組相比，pcD‐NA-DUSP6轉染組中DUSP6的相對mRNA 水平顯著升高（圖1A，P<0.05），而miR-145-5p 相對mRNA 水平顯著降低（圖1B，P<0.05），表明DUSP6 過表達HUVECs 細胞構建成功。HUVECs 細胞轉染miR-145-5p mimic 后結果顯示，與 Control 組相比，miR-145-5p mimic 轉染組中 miR-145-5p 相對 mRNA 水平顯著升高（圖1C，P<0.05），這表明miR-145-5p 成功轉染了HUVECs 細胞，并構建了穩定的miR-145-5p過表達HUVECs 細胞系。TargetScan 軟件預測miR-145-5p 可以直接結合到DUSP6 基因的3'-UTR 區（圖1D）。雙重熒光素酶報告基因檢測結果表明，miR-145-5p 可以顯著抑制DUSP6 3'-UTR-wt 載體的熒光強度，但不能抑制DUSP6 3'-UTR-mut載體的熒光強度（圖1E，P<0.05）。結果表明，miR-145-5p 和DUSP6具有良好的靶向關系。

圖1 miR-145-5p靶向DUSP6Fig.1 miR-145-5p targets DUSP6

2.2 miR-145-5p 過表達下調HUVECs 細胞中DUSP6 的表達水平 如圖 2A 所示，與 Control 組相比，LPS 組中miR-145-5p 表達水平顯著降低（P<0.05）。與 LPS 組相比，LPS+mimic 組中 miR-145-5p表達水平顯著升高，而LPS+DUSP6 組中miR-145-5p表達水平顯著降低（P<0.05）。與LPS+DUSP6 組相比，LPS+mimic+DUSP6 組中 miR-145-5p 表達水平顯著提升（P<0.05）。如圖2B 所示，與Control 組相比，LPS 組中 DUSP6 相對 mRNA 水平顯著升高（P<0.05）。與 LPS 組相比，LPS+mimic 組中 DUSP6 相對mRNA 水平顯著降低，而 LPS+DUSP6 組中 DUSP6 相對mRNA 水平顯著升高（P<0.05）。與LPS+DUSP6組相比，LPS+mimic+DUSP6 組中 DUSP6 相對 mRNA水平顯著降低（P<0.05）。如圖2C 所示，與Control組相比，LPS 組中DUSP6 相對蛋白水平顯著升高（P<0.05）。與 LPS 組相比，LPS+mimic 組中 DUSP6相對蛋白水平顯著降低，而LPS+DUSP6組中DUSP6相對mRNA 水平顯著升高（P<0.05）。與LPS+DUSP6 組相比，LPS+mimic+DUSP6 組中 DUSP6 相對蛋白水平顯著降低（P<0.05）。表明miR-145-5p 過表達可下調HUVECs細胞中DUSP6的表達水平。

圖2 5組細胞中miR-145-5p和DUSP6的表達水平Fig.2 Expression levels of miR-145-5p and DUSP6 in 5 groups of cells

2.3 miR-145-5p 過表達可抑制HUVECs 細胞凋亡 如圖 3A 所示，與 Control 組相比，LPS 組中細胞凋亡率顯著提升（P<0.05）。與LPS 組相比，LPS+mimic 組中細胞凋亡率顯著下降，而LPS+DUSP6 組中細胞凋亡率顯著升高（P<0.05）。與LPS+DUSP6組相比，LPS+mimic+DUSP6 組中細胞凋亡率顯著下降（P<0.05）。如圖 3B 所示，與Control 組相比，LPS組中Bax/Bcl-2 比率顯著提升（P<0.05）。與LPS 組相比，LPS+mimic 組中 Bax/Bcl-2 比率顯著下降，而LPS+DUSP6 組 中 Bax/Bcl-2 比 率 顯 著 升 高（P<0.05）。與 LPS+DUSP6 組相比，LPS+mimic+DUSP6組中Bax/Bcl-2 比率顯著下降（P<0.05）。表明miR-145-5p過表達可抑制HUVECs細胞凋亡。

圖3 5組細胞凋亡情況Fig.3 Apoptosis of 5 groups cells

2.4 miR-145-5p 過表達可緩解HUVECs 細胞氧化應激 如圖 4A 所示，與 Control 組相比，LPS 組中SOD 含量顯著降低（P<0.05）。與LPS 組相比，LPS+mimic 組中 SOD 含量顯著上升，而 LPS+DUSP6 組中SOD含量則顯著降低（P<0.05）。與LPS+DUSP6組相比，LPS+mimic+DUSP6 組中SOD 含量顯著上升（P<0.05）。如圖 4B 所示，與 Control 組相比，LPS 組中MDA含量顯著上升（P<0.05）。與LPS組相比，LPS+mimic 組中 MDA 含量顯著下降，而 LPS+DUSP6 組中MDA 含量則顯著升高（P<0.05）。與LPS+DUSP6 組相比，LPS+mimic+DUSP6 組中MDA 含量顯著降低（P<0.05）。表明miR-145-5p過表達可緩解HUVECs細胞氧化應激。

圖4 5組細胞氧化應激情況Fig.4 Oxidative stress of 5 groups cells

2.5 miR-145-5p 過表達可緩解HUVECs 細胞炎癥損傷 RT-PCR 檢測結果顯示，與Control 組相比，LPS 組中 iNOS 與 IL-10 相對 mRNA 水平顯著升高（P<0.05）。與LPS 組相比，LPS+mimic 組中 iNOS 相對mRNA水平顯著降低，而IL-10相對mRNA水平顯著升高（P<0.05）。與LPS 組相比，LPS+DUSP6 組中iNOS 相對 mRNA 水平顯著升高（P<0.05），而 IL-10相對mRNA水平無顯著性變化。與LPS+DUSP6組相比，LPS+mimic+DUSP6組中iNOS相對mRNA水平顯著降低，而IL-10相對mRNA水平顯著升高（P<0.05）。見圖5A。

ELISA 檢測結果顯示，與 Control 組相比，LPS 組中iNOS 與IL-10 含量均顯著升高（P<0.05）。與LPS組相比，LPS+mimic 組中iNOS 含量顯著降低，而IL-10 含量顯著升高（P<0.05）。與LPS 組相比，LPS+DUSP6 組中iNOS 含量顯著升高（P<0.05），而 IL-10含量無顯著性變化。與LPS+DUSP6 組相比，LPS+mimic+DUSP6 組中 iNOS 含量顯著降低，而 IL-10 含量顯著升高（P<0.05）。見圖5B。表明miR-145-5p過表達可緩解HUVECs細胞炎癥損傷。

圖5 5組細胞中炎癥相關因子含量Fig.5 Contents of inflammation related factors in 5 groups cells

3 討論

EC 功能障礙是引起多種心內科疾病的主要原因，尤其是老年疾病，如動脈粥樣硬化、類風濕關節炎、糖尿病等［15-17］。而內皮功能障礙的主要特征是炎癥損傷。炎癥是由有害刺激（如感染和壞死組織）引起的基本的先天免疫反應，通常以促炎細胞因子的產生為特征［18］。研究發現炎癥與人類慢性疾病的發病機理密切相關，并且炎癥通常伴隨氧化應激等不良反應。因此，炎癥過程的控制在預防相關疾病過程中起著至關重要的作用。

在這項研究中，以LPS誘導的HUVEC為炎癥損傷模型，探討了miR-145-5p 對氧化損傷和炎癥的調節作用及相關的分子機制。實驗結果顯示，DUSP6在LPS誘導的HUVECs 細胞炎癥模型中高表達。這一結果與 ZHANG 等［6］的研究結果相似，他們發現LPS處理巨噬細胞會上調DUSP6水平進而觸發炎癥細胞因子的產生，而DUSP6 抑制劑則減輕了LPS 誘導的小鼠巨噬細胞的炎癥反應［7］。在本研究中miR-145-5p 與DUSP6 抑制劑有著異曲同工的作用。并發現miR-145-5p 可以顯著抑制DUSP6 3'-UTR-wt 載體的熒光強度，但不能抑制DUSP6 3'-UTR-mut載體的熒光強度，預示著DUSP6 是miR-145-5p 調控的潛在靶標。進一步的實驗結果與預期相似，過表達的miR-145-5p 下調了 DUSP6 的表達水平，同時，miR-145-5p 過表達降低了iNOS 相對mRNA 水平并使IL-10 含量顯著升高。預示miR-145-5p 可以通過下調DUSP6水平抑制LPS誘導的HUVECs細胞的炎癥損傷。GU 等［19］研究發現，TUG1 抑制劑可以通過激活miR-145-5p/DUSP6 軸來緩解香煙煙霧引起的慢性阻塞性肺疾病炎癥和對氣道重塑的抑制作用。炎癥損傷過程中通常伴隨較為強烈的氧化應激反應。SOD 和MDA 是較為常見的氧化應激標志物。在本研究中LPS 組細胞中SOD 含量顯著降低而MDA 含量顯著上升。miR-145-5p 過表達顯著提高了HUVECs細胞中SOD含量并降低了MDA含量。

過度炎癥反應與氧化應激損傷會誘發細胞凋亡。研究發現多種miRNAs 可以介導細胞凋亡，miR-145-5p 亦包含在內［12，20］。在本研究中 miR-145-5p 過表達可以降低HUVECs 細胞的Bax/Bcl-2 比率，預示miR-145-5p具有抑制細胞凋亡的作用。

預防和控制炎癥反應及其相關反應的發生是預防EC 功能障礙的有效手段，對老年性疾病，如動脈粥樣硬化，心血管疾病等都有很好的作用。在本研究中miR-145-5p 過表達可以通過下調DUSP6 水平緩解HUVECs細胞氧化應激與炎癥損傷并抑制細胞凋亡。這預示DUSP6 是控制EC 炎癥障礙的潛在治療靶標，而運用miR-145-5p 調節是有前途的治療策略。