小分子多肽（FNS007）對關節炎大鼠T細胞亞群的影響①

張彥景 劉 琰 張建新 （河北醫科大學第一醫院，石家莊050031）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種進展性、破壞性滑膜炎，會影響骨骼和關節，被公認為是一種全身性自身免疫性疾病，T 細胞亞群失衡在其發病機理中非常關鍵［1］。目前RA 的治療藥物主要用于減輕患者疼痛，緩解癥狀，而針對其免疫學作用的藥物相對較少。FNS007 是一個小分子多肽，一種新型生物制劑，可直接作用于T 細胞，經過前期的研究發現FNS007 可明顯改善關節炎大鼠的炎癥評分，下調關節炎大鼠的炎癥細胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6 水平，對膠原誘導性關節炎（collagen-in‐duced arthritis，CIA）大鼠有治療作用［2］。本文在前期研究的基礎上分析其治療作用與調節T細胞亞群平衡的關系，為其進一步應用到臨床提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料 Lewis雌性大鼠，6~7周齡，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；牛Ⅱ型膠原蛋白（Collagen type Ⅱ）、不完全弗氏佐劑（incom‐plete Freund's adjuvant，IFA 購 自 Chondrex 公 司 ；FNS007 購自石家莊菲尼斯生物技術有限公司；FITC-anti-CD4抗體、PE-anti-IFN-γ抗體、PE-anti-IL-4抗體購自 BD 公司；PE-anti-IL17A 抗體、APC-anti-CD25 抗體購自 eBioscience 公司；PE-anti-Foxp3 抗體購自BioLegend 公司；電子天平（型號T5000）購自常熟市雙杰測試儀器廠；流式細胞儀（型號FACSCali‐bur）購自BD 公司；CO2培養箱（型號MCO-175）購自SANYO 公司；離心機（型號Centrifuge 5810R）購自Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 建立CIA 大鼠模型 在冰浴條件下，用0.05 mo/l L 乙酸溶液將Ⅱ型膠原均勻溶解，濃度為2 mg/ml，4℃過夜。然后將膠原溶液與相同體積的不完全弗氏佐劑混勻，充分乳化，取混合物100 μl于大鼠的尾根部皮內注射，1 周后重復此操作。每日早晚兩次觀察大鼠足爪變化，當大鼠關節腫脹且炎癥評分達到2 分時隨機入組，每組大鼠不少于8 只，另取8只空白大鼠作為對照，FNS007組按照0.5 m/l 100 g 的劑量尾靜脈注射給藥，兩日一次，模型組和空白對照組按照相同方式給予相同體積的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS），給藥21 d后處死大鼠。

1.2.2 大鼠一般狀態及體重變化 觀察各組大鼠的一般狀態，包括精神面貌、活動情況等，記錄體重，分析各組大鼠體重變化。

1.2.3 大鼠關節炎癥評價 根據大鼠關節狀況進行評分，嚴重程度：0 分=無關節腫脹；1 分=輕度，出現紅腫癥狀；2 分=中度，紅腫加重且大鼠行動稍有不便；3 分=重度，紅腫進一步加重，大鼠活動受限；4 分=超重度，大鼠關節出現畸形乃至不能負重。大鼠入組后兩天進行一次評分，直至給藥結束。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞分型 在大鼠炎癥評分最高時開始給藥，兩日一次，連續21 d，末次給藥結束后處死大鼠，腹主動脈取血，對血樣進行處理，取0.6 ml 血樣加入0.6 ml 培養基，并加入50 ng/ml的PMA及1 μg/ml的離子霉素，在37℃、5%CO2條件下孵育2 h，其后加入0.1%BFA 繼續孵育2 h 即可。在流式管中先加入胞外抗體（FITC-CD4 抗體及APC-CD25抗體），然后加處理好的血樣150 μl，振蕩混勻，避光孵育20 min。經過裂紅、固定、破膜，然后加相應的胞內抗體（PE-IFN-γ 抗體、PE-IL-4 抗體、PE-IL-17A 抗體、PE-Foxp3 抗體）進行細胞內染色，以同型匹配抗體處理的血樣作為陰性對照，流式細胞儀檢測并分析各細胞亞型的比例。

1.2.5 免疫組化檢測滑膜組織中IL-17 的表達 取膝關節滑膜組織制作石蠟切片，脫蠟水化，過氧化物酶內源性阻斷，微波爐內抗原修復，動物血清封閉，滴加一抗（兔抗1∶100），4℃ 過夜，加生物素化二抗（山羊抗兔）和SP 溶液，DAB 顯色，分化，脫水，透明，封片，光鏡觀察。用PBS替代一抗作為陰性對照，顯微鏡下觀察，細胞質及細胞核內棕黃色顆粒即為陽性表達。

2 結果

2.1 各組大鼠基本情況 空白對照組大鼠毛色鮮亮，精神狀態佳，活動自如，自給藥開始至結束的21 d 中體重平均增長28.13 g；模型組大鼠精神萎靡，行動不便，毛色臟污，足爪紅腫，與空白對照組相比，自第5 天開始體重明顯降低（P<0.01、P<0.05）；與模型組比較，FNS007組大鼠精神狀態有所好轉，體重在第5、7、9天明顯升高（P<0.05，圖1）。

圖1 FNS007對CIA大鼠體重的影響Fig.1 Effect of FNS007 on weight in CIA Rat

2.2 大鼠炎癥評分 與空白對照組比較，模型組大鼠炎癥評分從第1 天至21 天明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，FNS007 組大鼠炎癥評分在第2、3、4、5和7、8天明顯降低（P<0.05、P<0.01，圖2）。

圖2 FNS007 對CIA 大鼠炎癥評分的影響Fig.2 Effect of FNS007 on inflammation score in CIA rats

2.3 各組大鼠T 細胞分型情況 如表1 所示，模型組大鼠Th1、Th17 細胞所占比例較空白對照組明顯升高，Th2、Treg 細胞所占比例明顯降低（P<0.05、P<0.01）；與模型組相比，FNS007 組大鼠 Th1、Th17細胞所占比例降低，Th2、Treg 細胞所占比例升高（P<0.01，圖3）。

圖3 FNS007 對 CIA 大鼠 Th1、Th2、Th17、Treg 細胞分型的影響Fig.3 Effect of FNS007 on proportion of Th1，Th2，Th17，Treg in rats

表1 FNS007 對 CIA 大鼠T細胞分型的影響（）Tab.1 Effect of FNS007 on proportion of T cell in CIA rats（）

表1 FNS007 對 CIA 大鼠T細胞分型的影響（）Tab.1 Effect of FNS007 on proportion of T cell in CIA rats（）

Note：Compared with control group，1）P<0.01，3）P<0.05；compared with model group，2）P<0.01，4）P<0.05.

Treg（%）5.96±0.66 4.15±0.691）5.52±0.682）Groups Control Model FNS007 Th1（%）0.15±0.04 0.39±0.171）0.16±0.094）Th2（%）4.41±0.88 3.53±0.523）4.53±0.502）Th17（%）0.69±0.09 1.08±0.081）0.87±0.092）

2.4 各組大鼠滑膜組織中IL-17 染色結果 呈現在細胞核和細胞質里的黃棕色顆粒狀細胞為陽性染色的細胞，免疫組化結果顯示：空白對照組大鼠滑膜扁平，結構清晰，無炎癥細胞浸潤及血管增生，未見或少見IL-17 陽性染色細胞；而模型組大鼠滑膜組織粗糙，結構混亂，大量炎癥細胞浸潤，IL-17陽性染色細胞明顯增多，且多數集中在滑膜襯里層及襯里下層；與模型組比較，FNS007 組炎癥細胞少量存在，IL-17陽性染色細胞數明顯減少（圖4）。

圖4 FNS007 對CIA 大鼠滑膜組織IL-17表達的影響Fig.4 Effect of FNS007 on expression of IL-17 in CIA rats synovial tissues

3 討論

RA 是一種以關節滑膜腔內強烈的免疫激活和多種全身表現為特征的慢性炎癥性疾病，如果不及時治療，兩到三年后可能發生永久性傷殘，給患者帶來嚴重危害。目前RA 的病理生理機制尚不完全清楚，有文獻報道T細胞通過調節適應性免疫應答，在RA 的發展中發揮作用，作為T 細胞的主要子集，Th1、Th2、Th17和Treg細胞亞群的失衡十分關鍵，調節T 細胞極化可能是潛在的治療靶標［3-4］。FNS007是一條小分子多肽，其取代了Ⅱ型膠原肽中與T細胞結合的氨基酸，而與人類白細胞DR 抗原（HLADR）結合的氨基酸保持不變，在RA 發病的初始環節，與抗原提呈細胞表面的HLA-DRB1 競爭性結合，同時破壞自身抗原與HLA-DRB1 的結合，進而抑制“TCR-抗原肽-HLA”三分子復合物形成，阻斷T細胞激活的初始信號，從而延緩RA 的病情進展達到治療目的，屬于直接作用于T 細胞的生物制劑［5］。CIA 是一種成熟的關節炎模型，與RA具有相同的發病機制和生理特點，而Lewis 雌性大鼠的關節誘導發生率較高，對于評估抗RA 藥物的療效非常重要［6］。

在前期的藥效學基礎上，本課題組采用Ⅱ型膠原誘導Lewis 雌性大鼠制作CIA 模型，結果發現FNS007 在CIA 鼠模型中可發揮抗炎和免疫調節作用。與空白對照組相比，模型組T 細胞分化趨向Th1、Th17 型細胞，而向 Th2、Treg 型細胞偏移減少。Th1 細胞可促進補體定型、誘導與細胞毒性相關抗體產生［7］。據文獻報道，Th1細胞可分泌促炎癥細胞因子TNF-α和IFN-γ，TNF-α可誘導關節炎癥和血管翳的形成，導致軟骨和骨骼的侵蝕破壞；而IFN-γ 則通過激活巨噬細胞來推動炎癥的進展，在RA 關節組織和滑液中均可檢測到大量IFN-γ，T細胞分化偏向Th1細胞，表明炎癥細胞因子分泌會相應增加，從而加重關節炎癥［8］。對于Th2 細胞來說，其激活可以抑制RA 中的炎癥反應，IL-4是Th2細胞分泌的標志性細胞因子，體外研究發現，IL-4可通過影響破骨細胞和減少分泌促炎癥細胞因子來抑制骨吸收，而給予外源性IL-4 可以減輕CIA 小鼠的臨床癥狀、關節損傷和炎癥反應［9-10］。本實驗中，模型組T 細胞不正常偏移導致Th2 細胞減少，是誘發關節炎癥的原因之一。T 細胞分化向Th17 型細胞偏移同樣會加重關節炎癥，Th17 細胞主要通過分泌IL-17 促進自身免疫性疾病的進程，同時IL-17 又能進一步促進Th17 細胞的分化并增強Th17 細胞活性，IL-17 還可以誘導促炎細胞因子如 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的產生，并與其形成一個正反饋的環路［11］。本研究中，利用免疫組化技術特異性檢測滑膜組織中IL-17 的表達，模型組大鼠滑膜組織IL-17 表達升高，炎癥細胞浸潤，異常增生，符合關節炎模型大鼠T 細胞向Th17偏移的規律。與Th17細胞相反，Treg細胞介導抗炎反應，通過分泌IL-10和轉化生長因子TGF-β抑制其他T 細胞亞型，并保持自身免疫耐受狀態［12-13］。有研究發現，RA 患者滑膜中的炎癥細胞因子可抑制Treg 細胞增殖和分泌功能性細胞因子，在RA 發展進程中，Treg 細胞的比例呈減少趨勢［14-15］。本研究中模型組大鼠Treg 細胞比例明顯下降，與上述文獻報道一致。在給予FNS007 干預后，CIA 大鼠體內Th1/Th2/Treg/Th17 的比例發生變化，Th1、Th17 所占比例減少，而Th2、Treg 所占比例增加，表明FNS007 可以通過抑制Th1、Th17 的優勢應答，促進原始T 細胞向Th2、Treg 分化來發揮作用，滑膜組織中RA 的炎性生物標志物IL-17 的表達進一步佐證了這個論點。

綜上所述，FNS007 可以調節 Th1、Th2、Treg 和Th17 細胞的分化，減少向致炎型細胞Th1、Th17 轉化，增加向抑炎型細胞Th2、Treg轉化，通過恢復T細胞的正常平衡并干擾滑膜的免疫細胞入侵來治療或減輕RA 癥狀，這為其臨床治療RA 和其他T 細胞免疫相關疾病提供了新的治療策略。