嬰幼兒血管瘤的microRNA-circRNA芯片分析①

車霄楠 沙 巖 王 丹 （徐州市兒童醫院，徐州醫科大學附屬兒童醫院口腔科，徐州221000）

嬰幼兒血管瘤（infantile hemangioma，IH）是新生兒期最常見的良性腫瘤，由毛細血管內皮細胞及其支持組織良性增生所致，患病率占初生嬰兒的4%~5%［1-2］。隨著患兒生長發育，病變組織可逐漸消褪，亦可隨之逐漸發育成熟，內皮細胞逐漸形成血管，即形成由多個發育不完全的扭曲血管構成的腫物。雖然大多數病變可自然消退，但約12%的病例因并發癥需要治療，超過50%的未經治療的血管瘤可能導致永久的后遺癥［3-4］。血管瘤的主要治療適應癥包括危及生命的血管瘤、功能性血管瘤、潰瘍和嚴重的解剖變形［5］。

嬰幼兒血管瘤的發病機制尚不明確，目前認為異常的血管瘤細胞通過血管生成促進組織新生血管化［6-8］。microRNAs（miRNAs）已成為血管發育的關鍵調節因子，在多種疾病過程中調控異常，這些短的、非編碼的RNA 分子可抑制基因表達，通過誘導切割或阻斷靶mRNA 的翻譯［9］。最近一項研究表明，chromosome 19 miRNA 簇（C19MC）在IH 組織和血液樣本中均過表達，鑒定C19MC 為IH 的候選生物標志物［10-13］。miR-382 在 IH 中過表達內皮細胞并促進 IH 發展［14］。miR-130a 在 IH 中過表達，可促進血管內皮細胞的增殖、遷移和血管生成[15]。盡管如此，miRNA 在IH 中的作用尚需進一步研究。circ-RNAs 是最近發現的一類參與多種生理過程的ncRNAs，已被證明是調控基因表達的miRNA 海綿［15-16］。一些 circRNAs mRNA 競爭相同的 miRNA結合位點以形成整合的網絡后轉錄調控，即競爭內源性 RNAs（ceRNAs）網絡［17-18］。最近，circRNAs 的譜分析已在多種疾病特別是在腫瘤中被鑒定出來，如皮膚鱗狀細胞癌、卵巢上皮癌、基底細胞癌［19-21］。然而，關于IH 中circRNA 的研究還很少。因此，本研究主要對IH 細胞中miRNA 及circRNA 的表達及其潛在功能進行研究。

1 材料與方法

1.1 數據來源 本研究使用的miRNA 和circRNA測序數據分別是來自GEO 數據庫的GSE69136 和GSE98795 芯片。對于 miRNA，選取 GSE69136 芯片中的16 個樣本作為研究對象，其中12 個樣本來自患者血管瘤細胞，4 個樣本來自患者血管瘤組織臨近正常皮膚細胞；對于circRNA，選取GSE98795 芯片中血管瘤組織和臨近正常皮膚組織各4個樣本進行分析研究。

1.2 miRNA 差異分析 使用GEO2R 工具，對GSE69136 芯片中miRNA 測序數據進行差異表達分析。對分析結果，刪除參數殘缺的數據項，設置變數倍數和P值進行篩選，得到差異表達的miRNA（DEMis）。

1.3 circRNA 差異分析 使用GEO2R 工具，對GSE98795 芯片中circRNA 測序數據進行差異表達分析。對分析結果，刪除參數殘缺的數據項，設置變數倍數和P值進行篩選，得到差異表達的circ-RNA（DECis）。

1.4 預測miRNA-circRNA 相互作用關系 RNAhy‐brid 是 Behmsmeier M 等基于 miRNA 和靶基因二聚體二級結構開發的miRNA 靶基因預測工具［22］。本研究從miRBase 獲取人類miRNA 序列文件，從circ‐Base 獲取 DECis 的序列文件，使用 RNAhybrid 預測工具預測能夠與DECis靶向結合的人類miRNA。對預測的結果，保留DEMis 參與的相互作用對，使用Cytoscape軟件繪制相互作用網絡。

1.5 DEMis 的 KEGG 通路分析 使用David 6.8（http：//david. ncifcrf. gov/tools. jsp）進行差異基因Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）富集分析。以P<0.05 為顯著性富集，統計每個Path‐way 中的差異基因數目。通過KEGG 顯著性富集分析，確定DEMis參與的主要通路。

2 結果

2.1 miRNA 差異分析 對GEO2R 的分析結果以P<0.05，|log2FC|>1（fold change，FC）為標準篩選差異表達的miRNA，與正常皮膚細胞相比，血管瘤細胞中共得到139個DEMis，其中128個上調miRNAs，11 個下調 miRNAs（圖 1）。進一步按照|log2FC|>5 和P<0.05 分別篩選到 55 個上調 miRNAs 和 5 個下調miRNAs。按照差異miRNA倍數排序，表1列舉了前10個上調miRNAs和前10個下調miRNAs的信息。

表1 血管瘤細胞中上調/下調差異表達顯著的miRNAsTab.1 miRNAs with significantly up-regulated/downregulated expressions in hemangioma cells

圖1 血管瘤細胞miRNAs火山圖Fig.1 Volcanic plot of miRNAs in hemangioma cells

2.2 circRNA 差異分析 對GEO2R 的分析結果以P<0.05，|log2FC|>1 為標準篩選差異表達的circ-RNA，與正常皮膚細胞相比，血管瘤細胞中共得到1 000 個 DECis，其中 581 個上調 circRNAs，419 個下調circRNAs（圖2）。進一步按照|log2FC|>2 和P<0.05 分別篩選到 151 個上調 circRNAs 和 52 個下調circRNAs。按照差異circRNA 倍數排序，表2列舉了前 10 個 上 調 circRNAs 和 前 10 個 下 調 circRNAs 的信息。

表2 血管瘤細胞中上調/下調差異表達顯著的circRNAsTab.2 circRNAs with significantly up-regulated/downregulated expressions in hemangioma cells

圖2 血管瘤細胞circRNAs火山圖Fig.2 Volcanic plot of circRNAs in hemangioma cells

2.3 構建miRNA-circRNA 相互作用關系 將DECis 和人類miRNA 的序列文件上傳至RNAhybrid工具，設置配對次數為1，能量閾值-30，miRNA 5'端2~7 nt 完全配對，預測得到354 條相互作用關系，共涉及81個DEMis和35個DECis（圖3）。

圖3 血管瘤細胞中miRNA-circRNA相互作用網絡Fig.3 miRNA-circRNA interaction network in hemangioma cells

2.4 DEMis 的KEGG 通路分析 對血管瘤細胞中篩查出來的139 個差異表達的miRNAs 進行KEGG通路分析，以P<0.001 為標準篩查，有10.07%差異表達的miRNAs 富集在癌癥發生通路中，分別為miR520A、miR625、miR222、miR200A、miR203A、miR200B、miR200C、miR205、miR143、miR141、miR135B、miR150、miR23C、miR324，KEGG 通路分析顯示這些miRNAs 參與了肺癌、食管癌、肝細胞癌、結腸癌、乳腺癌、上皮性卵巢癌、膀胱癌及前列腺癌的信號通路，表明這些差異表達的miRNAs 可能在血管瘤的發生發展中發揮重要作用。

3 討論

IH 是內皮細胞和周細胞異常增殖引起的嬰幼兒最常見的良性血管瘤，具有典型的先快速增殖后緩慢消退的生長特點［2，23］。IH 的發病機制尚不明確，目前認為異常的血管瘤細胞通過血管生成促進組織新生血管化［6-8］。近年來，非編碼RNA對腫瘤發生發展作用的機制受到極大關注。miRNA 雖然是非編碼RNA，但其轉錄后基因調控發生在大量的細胞過程中，包括細胞增殖、分化、凋亡和血管生成［24-30］。且miRNA表達模式的改變與許多病理過程甚至一些癌癥的發生相關［31-35］。研究發現，miRNAs已成為血管發育的關鍵調節因子，在多種疾病過程中可抑制基因表達，通過誘導切割或阻斷靶mRNA的翻譯［9，36］。隨著對 miRNA 的深入探索，多種 RNA分子對miRNA 的吸附作用逐漸被發現，這種作用使miRNA 成為復雜調節鏈中重要的一環，這樣有競爭結合miRNA 引發的調節機制被稱為ceRNA 機制。其中，circRNA 作為 miRNA 海綿，在 ceRNA 機制中發揮重要作用，miRNA-circRNA 作為腫瘤生物標記物的研究也越來越多。本研究主要通過分析IH 相關的miRNA 及circRNA 的高通量測序芯片，構建miRNA-circRNA 相互作用關系，探索血管瘤潛在的生物標記物。通過GSE69136數據分析miRNA 差異表達，最終得到139 個DEMis，其中大部分DEMis 為表達上調miRNAs。進一步的KEGG富集分析發現，這些DEMis 中有14 個miRNAs 富集在癌癥發生通路。通過GSE98795數據分析circRNA 差異表達，在血管瘤細胞中共得到1 000 個DECis，其中581 個上調 circRNAs，419 個下調 circRNAs。進一步根據|log2FC|>2 和P<0.05，分別篩選到 151 個上調 circ-RNAs 和 52 個下調 circRNAs。將 DECis 和人類 mi-RNA 的序列文件上傳至RNAhybrid 工具，預測得到354 條相互作用關系，共涉及 81 個 DEMis 和 35 個DECis。對 DEMis 的 KEGG 通路分析發現，有 14 個差異miRNA 富集在癌癥發生通路中。通路分析顯示這些miRNAs 參與了肺癌、食管癌、肝細胞癌、結腸癌、乳腺癌、上皮性卵巢癌、膀胱癌及前列腺癌的信號通路，表明這些miRNAs 可能在血管瘤的發生發展中發揮重要作用。

綜上所述，通過對GEO 數據庫中的IH 芯片數據進行分析，本研究獲取了IH 中差異表達的mi-RNAs 和circRNAs。通過信號通路富集分析發現，在IH 發生發展過程中起重要作用的信號通路為癌癥發生信號通路，關鍵miRNAs 可能為miR520A、miR625、miR222、miR200A、miR203A、miR200B、miR200C、 miR205、miR143、miR141、miR135B、miR150、miR23C、miR324，這為探索 IH 的發生機制提供重要依據。