復發緩解型多發性硬化患者外周血miR-132、miR-146a與認知障礙的關系①

謝 陽 劉夢蘭 羅思維 孟仁亮 呂志宇 （西南醫科大學附屬醫院神經內科，瀘州646000）

多發性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種以中樞神經系統（central nervous system，CNS）白質的慢性炎性脫髓鞘為主要病變特點的疾病，MS的發病率在20~40 歲時最高，是致殘中青年人的主要疾病之一［1］。MS 患者臨床的癥狀多樣，除較為常見的運動障礙、視覺異常及自主神經功能障礙以外，認知功能障礙也是常見的癥狀之一［2］。對MS 的臨床樣本和社區研究中發現，約60%的患者存在不同程度的認知功能障礙，表現為瞬時記憶及長期記憶力的下降，執行能力、視覺空間能力、注意力和處理信息速度等認知能力的下降［3］。而臨床MS 患者仍以輕度認知障礙（cognitive impairment，CI）較為常見。而miRNA 作為真核生物的一類內源性非編碼RNA，能夠對mRNA 的表達進行轉錄后水平的調控，并且研究發現其在細胞生長、分化增殖及凋亡中發揮關鍵作用，參與一系列生命進程，并在多種自身免疫性疾病的進展中發現其可以對免疫系統發揮調節功能，作為自身免疫性疾病之一的MS，也被證實存在異常的 miRNA 表達，其中 miR-146a 及 miR-132 被發現在 MS 高峰期時異常表達［4-5］，同時 miRNA 被證實在不同疾病引起的認知功能障礙中起關鍵調控作用，然而在RRMS 中導致認知功能障礙的作用尚不清楚。本研究通過對RRMS 患者血清miR-132 及miR-146a 的水平測定，分析其與認知功能障礙MMSE 評分的相關性和獨立危險因素分析，探究RRMS患者認知功能障礙嚴重程度與miR-132、miR-146a的關系，為臨床的診治提供理論證據。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 本研究通過西南醫科大學附屬醫院倫理委員會批準，所有研究對象及家屬均簽署知情同意書。納入西南醫科大學附屬醫院神經內科2018年6月至2020年5月期間收治的RRMS患者80 例，其中男 26 例，女 54 例，年齡 20~49 歲，平均（32.19±5.07）歲。入組標準：①符合MS 診斷與治療的中國專家共識［6］；②分型為復發緩解型，并正處于急性發作期；③完善頭顱及脊髓MRI 檢查；④患者均知情同意并簽署知情同意書；⑤意識清楚，能配合完成研究者；排除標準：①有嚴重的心肝腎等器質性疾病；②合并有惡性腫瘤、嚴重感染及意識障礙不能配合研究者；③本次患病以前已經出現認知功能障礙者；④其他可能引起認知功能障礙或意識障礙的神經系統疾病；⑤合并其他自身免疫性疾病者；⑥有長期精神活性藥物依賴或大量飲酒史。

1.1.2 主要試劑與儀器 M-MLV 逆轉錄試劑盒（TIANGEN，中國）；miRNA 熒光檢測試劑盒（QIA‐GEN，德國）。

1.2 方法

1.2.1 分組及認知功能測定 所有納入的患者在入院首日采用簡明精神狀態量表（mini-mental state examination，MMSE）對認知功能進行評估。其中MMSE 最高為30分，最低為0分，分值越低代表認知功能障礙越嚴重。按國際化標準：以26 分為界限，21~26 分者為輕度 CI，10~20 分者為中度 CI；<10 分者為重度CI。依據MMSE 量表結果將所有納入的RRMS患者分為2組，分別為有認知障礙的RRMS患者，即CI 組，和未發生認知障礙的RRMS 患者，即無CI 組。其中 CI 組共 39 例，男 12 例，女 27 例，年齡21~48歲，平均（30.28±5.24）歲，文盲4例，小學10例，中學及以上學歷25 例。而CI 組又根據MMSE 評分結果分為輕度 CI 組 20 例，中度 CI 組 13 例，重度 CI組 6 例。而無 CI 組共 41 例，男 14 例，女 27 例，年齡22~49 歲，平均（31.27±4.88）歲，文盲 5 例，小學11 例，中學及以上學歷25 例。兩組在年齡、性別及文化程度方面相互匹配，差異無統計學意義（P>0.05）。

1.2.2 純化miRNA 和總RNA 提取 所有受檢者在清晨抽取3 ml 靜脈血，室溫自然凝固15 min，4 000/rmin 快速離心5 min，取上層血清置于-80℃超低溫冰箱保存備用。TRIpure 試劑提取總mi-RNA。將提取的 miRNA 置于 30 μl DEPC 水中，56℃水浴15 min 加速RNA 溶解。提純后的miRNA使用M-MLV 逆轉錄試劑盒完成第1 鏈cDNA 合成，并使用miRNA 熒光檢測試劑盒，采用SYBR Green嵌合熒光法的原理完成miRNA 熒光定量檢測。以上操作過程均按照相關試劑盒說明書進行，反應體系為20 μl，引物設計使用Primer 5.0 軟件完成，具體引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 RT-PCR primer sequence

定量PCR 的反應條件為：95℃處理5 min，95℃變性10 s，再經退火和延伸60℃36 s，重復進行40個循環。所有的數據使用ABI 7300 SDSvl. 2x System該軟件處理，依靠軟件的自動分析功能獲取相應Ct值，采用2-ΔΔCt計算出目的基因相對含量，單樣品進行3次測定后軟件分析獲取出相應Ct平均值。

1.3 統計學處理 采用SPSS20.0對所有數據進行分析，計量資料用表示，兩獨立樣本均數間的比較采用t檢驗，多個獨立樣本均數間的比較采用ANOVA 單因素的方差分析，計數資料以百分比表示，兩組間比較采用卡方檢驗，采用Pearson 檢驗對變量間的關系進行相關性分析，多因素分析采用二元回歸Logistic 回歸分析，P<0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料對比 RRMS患者CI組在性別、年齡、病程長短、發作次數、吸煙、飲酒和高血壓、冠心病、糖尿病等合并癥方面與無CI組相比較差異無統計學意義（P>0.05，表2）。

表2 各組一般資料比較Tab.2 Comparison of general data in each group

2.2 各組miR-132、miR-146a 的相對表達量的比較 RRMS 患者CI 組的不同程度CI 亞組外周血清中miR-132 及miR-146a 的表達水平均明顯高于無CI組，差異均有統計學意義（P<0.05）。CI組中各亞組比較，重度CI 組患者外周血清的miR-132、miR-146a 水平較輕度CI 組和中度CI 組均明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05，表3）。

表3 各組外周血清miR-146a、miR-132相對表達量Tab.3 Relative expression levels of miR-146a and miR-132 in peripheral blood of each group

2.3 CI 組外周血 miR-132 及 miR-146a 相對表達量與MMSE 評分相關性分析 CI 組外周血miR-146a和miR-132 水平與MMSE 評分均呈負相關（r2=0.907 6，P<0.01，r2=0.916 7，P<0.01）。見圖1。

圖1 CI 組 MMSE 評分與 miR-146a、miR-132 相對表達量的相關性Fig.1 Correlation between MMSE score and relative ex?pression levels of miR-146a and miR-132 in CI group

2.4 Logistic 回歸分析 將RRMS 患者是否合并CI作為因變量，有統計學意義的指標miR-146a、miR-132 的相對表達量作為自變量進行Logistic 回歸分析發現，miR-146a、miR-132 為 RRMS 患者合并 CI 發生的獨立危險因素，見表4。

表4 CI的Logistic回歸分析Tab.4 Logistic regression analysis of CI

3 討論

MS 作為一種以中樞神經系統的髓鞘脫失為主要特點的炎性自身免疫性疾病，研究普遍認為其屬于自身免疫性疾病，相關文獻報道，MS 伴有認知功能障礙的發生率高達65%，CI 通常影響多個不同的認知領域，在臨床上表現出不同形式，比如信息的處理能力、近遠時記憶力、執行力和注意力等［7］。部分研究者發現RRMS 患者N-乙酰門冬氨酸和谷氨酸-谷氨酰胺的神經遞質代謝異常是引起CI 的原因，也有研究發現MS 患者的認知功能障礙與軸索廣泛損害及神經元的變性相關［8-9］。雖然近年對MS伴發的CI研究逐漸深入，但目前就其造成認知功能障礙的相關機制仍不明確。而miRNAs 是一類內源性的有調控功能的非編碼RNA，中樞神經系統的miRNAs 有潛在的免疫誘導作用［10］。近年研究發現，miRNA 在神經元分化、軸突形成、突觸的可塑性過程及大腦的發育中發揮重要作用，并與大腦的記憶學習能力和認知功能緊密相關，在一些以記憶損害和進行性認知障礙為臨床表現的神經退行性疾病中起關鍵作用［11-12］。

miR-146a 作為miR-146 家族一員，是一種對TLR及細胞因子的受體信號通路進行調控的內源性相關調節因子，能夠通過負反饋調節多種炎癥信號通路而參與多種疾病發生發展［13］。同時研究證實，miR-146a 在阿爾茨海默病（AD）等神經退行性疾病患者腦部表達水平上調，且在患者外周血中發現miR-146a 的AA 型等位基因相對表達量的上調可增加AD 患者認知功能障礙的罹患率［14］。而作為大腦中主要功能物種的miR-132，其受到腦源性神經生長因子相應的刺激后開始上調，引起樹突軸突的成長及突觸的可塑性，從而在MS 及其他多種疾病的發生發展中發揮重要作用［15-16］。miR-132 對靶基因MecP2 的特異性負向調節，其過度表達會引起認知功能障礙及精神癥狀的出現［17］。已有研究表明，miR-146a、miR-132 在 MS 患者外周血中高表達［18］。本研究發現RRMS 患者CI 組的不同程度認知障礙亞組外周血中miR-132及miR-146a表達水平均明顯高于無CI 組，而CI 組中各亞組進行比較，重度CI 組患者外周血清的miR-132、miR-146a 水平較輕度CI組和中度CI 組均明顯升高，提示miR-146a、miR132參與了RRMS疾病進展，與既往研究相一致，同時本研究發現二者可能與RRMS 伴發的CI 嚴重程度有關，對 CI 組外周血 miR-132 及 miR-146a 相對表達量與MMSE 評分相關性分析，及對RRMS 患者合并CI發生的獨立危險因素的Logistic回歸分析發現，miR-132、miR-146a 與 MMSE 評分均呈負相關，且高表達的 miR-132 和 miR-146a 是 RRMS 患者 合并 CI 發生的獨立危險因素，提示miR-132、miR-146a 的表達水平與RRMS 患者伴發的CI 有關，二者表達水平越高RRMS患者CI越重。

綜上所述，miR-146a、miR-132 參與了 RRMS 患者CI發生的過程，可能與其炎癥反應的調節和突觸可塑性等生理功能相關，推測miR-146a 及miR-132有作為MS 神經行為生物學標志物的可能，為MS 伴發認知功能障礙的病患的診斷提供新的證據。