循環血液中的環狀RNA在消化系統腫瘤中的研究進展①

楊立羊 張新軍③ 王慶領 苗 吉 （寧波市北侖區人民醫院，寧波315826）

消化系統腫瘤嚴重威脅全球人類生存健康。據最新全球研究報告顯示，全球發病率最高的10種腫瘤中消化系統腫瘤占據5 種，分別為結腸癌、胃癌、肝癌、直腸癌、食管癌，死亡率最高的10 種腫瘤中消化系統腫瘤占據6 種，分別為胃癌、肝癌、結腸癌、食管癌、胰腺癌、直腸癌，并且消化系統腫瘤的發病率呈逐年上升趨勢［1］。目前，用于消化系統腫瘤的診斷及預后評估的常用方法包括內鏡檢查、腫瘤標志物（CEA、CA199、AFP 等）檢測、影像學檢查等，由于侵入性、敏感性和特異性較低，它們在臨床應用中存在一定的局限性［2-3］。因此尋找侵入性小，敏感性及特異性高的檢測方法用于消化系統腫瘤的早期診斷及預后評估非常重要。

環狀 RNA（circular RNAs，circRNAs）由線性前體mRNA 反剪接產生，是一種沒有游離3'-5'末端的共價閉環結構的RNA 分子，具有數量多、結構穩定、高度保守、特異表達等特性［4］。它能通過充當mi-RNA 分子海綿、調節基因轉錄及剪接、參與蛋白質的翻譯等參與腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲、轉移及腫瘤進展等病理過程［5-7］。近幾年來，研究發現人類血液中存在成千上萬的circRNAs，并且它們高度穩定，能夠抵抗高溫、極端酸堿度以及長期冷凍貯藏等惡劣條件［8-9］。以上發現表明了circRNAs 具有作為腫瘤循環生物標志物的潛力。本文就循環血液中circRNAs 的來源以及其在消化系統腫瘤中的臨床價值進行總結，旨在為消化系統腫瘤的診斷及預后提供新的非侵入性生物標志物，為其治療靶點的選擇提供參考。

1 循環血液中circRNAs的來源

對于循環血液中circRNAs 來源的猜測主要來自以下幾個方面：①外泌體是主要來源：外泌體是由細胞產生、脫落進入體液循環的囊泡，它可攜帶circRNAs 等多種分子進入血液循環，通過在血液中轉移這些分子參與細胞間的通訊，進而影響腫瘤的生物活性，如增殖、侵襲和轉移、免疫調節、轉移前生態位的生成和血管生成的刺激［10-11］；②組織或細胞的損傷、壞死或凋亡被動釋放RNA：正常情況下，細胞內的ncRNAs 不易進入循環，但在組織損傷或細胞壞死時會發生，破損細胞和組織的被動泄漏是一個不需要能量的過程。在腫瘤轉移或慢性炎癥的情況下，原發部位的組織或細胞可能破裂，釋放細胞內的ncRNAs 進入循環［12］。某些血細胞（如血小板和單核細胞）也可通過這種被動方式釋放RNA進入循環，因為它們的半衰期相對較短；③細胞主動釋放RNA：細胞直接釋放無外泌體包被的RNA ，其方式與釋放某些激素和細胞因子類似，首先將RNA 裝入細胞內的小的分泌囊泡或顆粒中，然后通過分泌囊泡或顆粒與細胞膜融合，將RNA 釋放到循環中。與激素和細胞因子的分泌類似，這種分泌方式可在有或無細胞刺激的情況下發生［13-14］；④其他來源：治療干預也可能導致循環核酸的存在［15］。

2 循環血液中的circRNAs 在消化系統腫瘤中的臨床作用

隨著生物學技術的發展，目前發現循環血液中的circRNAs 在腫瘤的早期診斷、預后評估以及藥物療效預測方面發揮著重要作用［16-17］。并且研究表明，在消化系統腫瘤診治中，血液中的circRNAs 將能為其提供非侵入性生物標志物，并能在其治療靶點的選擇上提供參考（如表1）。

表1 循環血液中的環狀RNA在消化系統腫瘤中的作用Tab.1 Role of circRNAs from circulating blood in digestive system neoplasms

3 循環血液中的circRNAs與食管癌（esoph?agus cancer，EC）

EC 發病率及死亡率較高，90%的EC 為食管鱗癌（esophageal squamous carcinoma，ESCC）［43］。近年來，盡管在ESCC 治療方面取得了一定進展，但患者預后仍較差，5 年總生存率僅為 20%~30%［44］。目前臨床上診斷ESCC 的血清學指標敏感性和特異性較低。因此探索新的血清學標志物用于EC 的診斷及預后是至關重要的。

3.1 診斷價值 WANG 等［18］在對比 87 例 ESCC 患者和53例健康人血漿中circ_SLC7A5的表達水平時發現，circ_SLC7A5 在ESCC 患者血漿中的表達水平明顯升高，建構受試者工作特征（relative operating characteristic，ROC）曲線評估診斷價值顯示，ROC 曲線下面積（area under the curve，AUC）為0.771 7，說明circ_SLC7A5對ESCC具有較好的早期診斷價值。

3.2 預后價值 血漿中的circ_SLC7A5 在ESCC 患者預后評估上也具有重要作用。研究顯示circ_SLC7A5 與 TNM 分期呈正相關，且 Kaplan-Meier生存分析和log-rank 檢驗結果顯示，與circ_SLC7A5表達水平較低的ESCC 患者相比，circ_SLC7A5 表達水平較高的ESCC 患者生存時間明顯縮短。另外單因素和多因素分析表明，circ_SLC7A5 表達水平和TNM分期均為ESCC患者總體生存率（overall survival，OS）的獨立預后指標［18］。由此說明血漿中異常表達的circ_SLC7A5 對ESCC 具有較好的早期診斷及預后評估價值，有望成為非侵入性生物標志物。

4 循環血液中的circRNAs 與胃癌（gastric cancer，GC）

GC的診治仍然是腫瘤學領域的一個挑戰，其生存率、治愈率低，復發率高，預后差，且目前國內對GC 的早期診斷率不高［45］。近年來，大量研究顯示，血液中異常表達的circRNAs 可能成為GC 診斷、進程監測及預后評估的特異標志物，對GC 患者的診治及預后評估具有重要臨床意義。

4.1 診斷價值 GC 患者血漿中circ_0000520 的表達較正常人明顯下調，建構ROC 曲線分析發現，其AUC 為0.896 7，敏感性及特異性分別為82.35%、84.44%。并且circ_0000520 表達水平在CEA 陽性患者中較低，但表達水平與其他臨床病理特征無關系［21］。說明血漿中 circ_0000520 對 GC 患者具有較好的診斷價值。circ_0000190 在GC 患者組織及血漿中表達下調。血漿中circ_0000190 表達水平與CEA 相關，CEA 陽性患者 circ_0000190 水平較高。分析血漿中circ_0000190 的診斷價值，提示AUC 為0.60，敏感性為0.414，特異性為0.875。并且組織和血漿中的circ_0000190 聯合診斷時，其敏感性和特異性明顯增加，分別為 0.712 和 0.750，AUC 增加到0.78，因此circ_0000190作為一種血液標志物，可能提高GC 的診斷價值［22］。血漿中的circ_0001017和circ_0061276可以有效區分GC 患者與正常人群，構建ROC 曲線分析發現，血漿circ_0001017、circ_0061276的AUC值分別為0.851、0.849，顯著高于組織中同類circRNAs 的診斷價值，并且血漿中這兩種circRNAs 聯合診斷時，AUC 升高至 0.912，此外，組織與血漿中的circRNAs 聯合診斷時，較單一組織circRNAs 的靈敏度及特異度增加，并且陽性預測值（relative positive predictive value，PPV）和陰性預測值（negative predictive value，NPV）明顯增加，顯著提高了診斷的準確性［23］。

4.2 預后價值 Circ_002059 在GC 患者中表達下調，對GC 患者具有較高的診斷能力。此外，circ_002059 低表達與患者遠處轉移、TNM 分期顯著相關，并且GC 患者術前、術后血漿中的circ_002059表達水平具有顯著性差異［24］。由此說明，circ_002059也是胃癌的預后因素。在GC 患者組織及血漿中，circ_0001017和circ_0061276表達均明顯下調，術后患者血漿中的兩種circRNAs 表達水平顯著升高，恢復至正常人水平，并且術后表達水平恢復組的GC患者，無論術前在何分期，均有較長時間的無病生存率（disease free survival，DFS）。此外，術后血漿中circ_0001017 表達水平恢復情況可以作為GC 患者DFS 的獨立預后指標。另外，組織及血漿中circ_0001017、circ_0061276 表達水平與遠處轉移和腫瘤大小相關，血漿中circ_0001017 和circ_0061276 水平的降低與較高的總體死亡率和TNM III-IV期顯著相關，并且低表達組OS明顯低于高表達組。單變量分析和多變量分析顯示，血漿circ_0001017 和circ_0061276是GC患者OS的獨立預后指標［23］。

4.3 治療靶點 血漿circ_0021087 不僅對GC 患者具有較好的診斷及預后評估價值，而且還能提供治療靶點。circ_0021087 在GC 的血液和細胞中顯著下調，下調的circ_0021087 促進GC 細胞的增殖、遷移。通過對胃癌circ_0021087-miRNA-mRNA 調控網絡的預測，確定了3種miRNA（miR-1286、miR-184和miR-450b-3p）及205 個靶基因，生物信息學分析顯示此調控網絡可能與GC 發展有關［25］。由此說明circ_0021087可能是GC的治療靶點。

5 循環血液中的circRNAs 與胰腺癌、膽管癌（cholangiocarcinoma，CCA）

胰腺導管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）及CCA 是常見的消化系統惡性腫瘤，早期診斷難度大，發展迅速，侵襲轉移能力強，復發率及死亡率高［29，46］。因腫瘤對放化療敏感性差，目前手術治療是唯一可行的治療方式［47］。此外，近年來腫瘤發病率呈上升趨勢，因此迫切需要尋找合適的生物標志物以及檢測對PDAC及CAA特殊的治療靶點。

5.1 診斷價值 研究發現circ_0000284 不僅在CCA 細胞、組織中表達上調，而且在患者血漿外泌體中表達也明顯上調。有趣的是，外泌體介導的circ_0000284 對周圍正常細胞具有促癌作用。進一步的實驗探索了circ_0000284 的致癌機制，發現它可通過競爭性結合miR-637，導致淋巴細胞抗原-6e（lymphocyte antigen-6e，LY6E）表達增加，進而引起CAA 的發生發展［27］。由此說明，血漿外泌體 circ_0000284 可作為CCA 非侵襲性的診斷性標志物，同時也能提供治療靶點。

5.2 預后價值 血漿外泌體circ_PDE8A 表達水平在PDAC 患者中明顯升高，并且circ_PDE8A 的高表達與十二指腸侵犯、血管侵犯以及TNM 分期有關。生存分析顯示，外泌體circ_PDE8A 高表達與低生存率有關，多變量分析也表明，外泌體circ_PDE8A 高表達是OS 的獨立風險因素［28］。因此，血漿外泌體circ_PDE8A 的高表達是個預后不良因素。研究發現circ_IARS 在轉移性胰腺癌患者的血漿外泌體中表達上調，并且circ_IARS 的高表達與腫瘤血管浸潤、肝轉移、淋巴結轉移以及TNM 分期有關。單因素及多因素生存分析顯示，circ_IARS 高表達是影響胰腺癌患者預后的獨立危險因素，并且生存曲線分析提示，circ_IARS 高表達組患者的生存時間明顯短于circ_IARS低表達組［29］。由此可見，血漿外泌體中異常表達的circ_IARS 是影響胰腺癌患者預后的一個主要因素。

5.3 治療靶點 血漿外泌體circ_PDE8A 與PDAC患者的腫瘤侵襲和進展相關。上調circ_PDE8A 可促進PDAC 細胞的遷移和侵襲，抑制circ_PDE8A 的表達過程則被阻斷。進一步研究發現circ_PDE8A的促癌作用與circRNA-miRNA-mRNA 調控網絡有關，circ_PDE8A 通過海綿 miR-338 從而上調MACC1，進而刺激MET 通路促進腫瘤進展，另外ERK 通路也被證實與腫瘤侵襲有關［28］。因此，circ_PDE8A 可作為分子靶點用于胰腺癌的靶向治療。血管內皮通透性的增加與腫瘤轉移及侵襲有關。研究發現，血漿外泌體中表達上調的circ_IARS可增加血管內皮的通透性，并且發現circ_IARS發揮這種效應與其競爭性結合miR-122，下調miR-122的表達，增加下游靶基因RhoA 的表達和活性有關，而circ_IARS 表達受抑制時，此通路效應則相應被阻斷［29］。由此可見，血漿中circ_IARS/miR-122/RhoA通路可能為轉移性胰腺癌治療藥物的研發提供思路。

6 循環血液中的circRNAs與肝癌

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的原發性肝癌，也是世界范圍內癌癥相關死亡的主要原因。90%HCC的發生與慢性肝病和肝硬化有關［48］。盡管目前檢測方法廣泛應用，但70%的HCC 患者在晚期才被確診［49］。因此，闡明 HCC 發生發展的生理病理機制，尋找有效的診斷和治療靶點是當務之急。

6.1 診斷價值 研究發現，表達上調的circ_00-51443 可在G0/G1 期阻滯細胞周期進程，促進HCC細胞凋亡，抑制細胞增殖。qRT-PCR 結果顯示，HCC 患者血漿外泌體中的circ_0051443表達水平明顯低于健康對照組。構建ROC 曲線檢測血漿外泌體circ_0051443 區分HCC 患者與正常人的價值，提示AUC為0.808 9［30］。說明血漿外泌體circ_0051443具有較好的早期診斷價值。ZHANG 等［31］對 104 例HCC 患者、57 例肝硬化患者、44 例乙型肝炎患者和52例健康對照者的血漿circ_0001445表達水平分析時發現，HCC 患者血漿circ_0001445表達水平最低，肝硬化及乙型肝炎患者其次，并且circ_0001445 表達水平與血清AFP 水平相關，血清AFP< 20 μg/L HCC 患者的血漿circ_0001445表達水平顯著低于血清 AFP≥20 μg/L HCC 患者。構建 ROC 曲線區分HCC患者與健康對照組，提示AUC為0.862，特異性和敏感性分別為94.2%和71.2%，此外，血漿circ_0001445 也可用于區分HCC 患者與肝硬化患者（AUC=0.672），和乙型肝炎患者（AUC=0.764）。其次，血漿circ_0001445 聯合AFP 診斷時，各對比組AUC 明顯增加，較單純使用血漿circ_0001445 或血清 AFP 診 斷 準 確 性 更 高［31］。 因 此 ，血 漿 circ_0001445可能成為一種新的診斷HCC的生物標志物。

6.2 預后價值 外泌體circPTGR1 能促進HCC 細胞的侵襲及遷移，與HCC 患者預后不良有關。研究發現，circPTGR1 在HCC 不同臨床分期中的表達差異顯著，表達水平隨著TNM 分期進展而升高。生存分析顯示，circPTGR1 水平低的患者生存率高于cir‐cPTGR1 水平高的患者，提示circPTGR1 低表達的HCC 患者預后優于circPTGR1 高表達的HCC 患者［32］。研究發現circ_100338 在轉移性肝癌細胞及其分泌的外泌體中均為高表達，并且circ_100338表達水平與HCC 細胞的轉移能力呈正相關。術后患者血清外泌體circ_100338 的變化可以早期預測HCC 的肺轉移，且敏感性高于AFP。此外，在接受根治性肝切除術的HCC 患者血清中，外泌體circ_100338 的持續高表達可能是肺轉移和生存不良的風險指標［33］。

6.3 治療靶點 體內外實驗表明外泌體circ_0051443可顯著抑制HCC增殖，進一步研究顯示，這種抑制作用可能通過上調BAK1 表達實現。BAK1是miR-331-3p 的潛在靶基因，miR-331-3p 模擬物能降低BAK1表達，然而上調的外泌體circ_0051443能顯著抑制這種作用。由此說明，circ_0051443 可以通過海綿miR-331-3p 進而調控BAK1 表達，抑制HCC 進展［30］。提示 circ_0051443 可能是 HCC 治療的一個關鍵靶點。circPTGR1 在HCC 中表達上調，進一步研究發現，外泌體circPTGR1 可通過circPT‐GR1-mir449a-MET 通路促進HCC 的遷移和轉移。circPTGR1 的表達水平與MET 水平呈正相關，與miR449a 呈負相關，另外，miR449a 的高表達，可導致MET 水平降低，而miR449a 表達受抑制，能使MET 水平升高，此外，敲低circPTGR1 可逆轉miR449a水平的降低和MET表達水平的升高［32］。由此說明，circPTGR1-mir449a-MET 是促進 HCC 進展的關鍵，circPTGR1可能是HCC治療的靶點。

7 循環血液中的circRNAs 與結直腸癌（colorectal cancer，CRC）

CRC 是世界上最常見的癌癥之一，發病率位居第三，死亡率位居第二［1］。導致CRC 生存率較低的主要原因是缺乏合適的早期診斷方法，以及不能采取及時有效的治療方式。因此，找到理想的生物標志物和治療靶點是提高CRC生存率的重要突破口。

7.1 診斷價值 與健康對照組相比，CRC 患者血漿 中 3 種 circRNAs（circ_CCDC66、circ_ABCC1 和circ_STIL）的水平明顯降低。ROC 曲線分析顯示，3 種 circRNA 組合面板的 AUC 值為 0.780，診斷價值高于CEA 和CA199。將3種circRNA 與CEA、CA199聯合應用時，可提高CRC 的診斷能力，AUC 提升為0.855。此外，在CRC 癌前病變患者血漿中，circ_CCDC66 和circ_ABCC1 水平降低，術后血漿circ_CCDC66 水平明顯升高。另外，這3 種circRNA組合面板提高了診斷CEA 和CA199 陰性CRC 的能力［36］。PAN 等［38］對CRC 患者、良性的腸道疾?。╞e‐nign intestinal diseases，BIDs）患者以及健康人血清外泌體中circ_0004771 水平分析時發現，CRC 患者血清外泌體circ_0004771 表達明顯上調，其術后表達明顯降低。并且發現circ_0004771 具有很高的早期診斷價值，在區分早期CRC 患者及各分期CRC 患者與健康人時AUC 分別為0.86、0.88，并且敏感性及特異性較好。此外，對于良性病變與早期CRC 也具有良好的鑒別能力，AUC 為0.81，敏感性為81.43%，特異性為74.29%，說明circ_0004771 有望成為循環腫瘤標志物用于CRC 早期診斷。CRC 血漿中 circ_0082182、circ_0000370 明顯上調，而 circ_0035445 表達下調，與其在組織及細胞中的表達方式相同。在診斷價值方面，circ_0000370 的AUC 最高，為 0.8152，circ_0082182 、circ_0035445 的 AUC分別為0.7371、0.7028。當三者聯合時AUC 增加至0.8347，突出了它們作為一組早期診斷CRC 標志物的優越性［39］。

7.2 預后價值 血漿circ_ABCC1 除了具有診斷價值以外，它還與CRC 預后有關。研究發現血漿circ_ABCC1 表達水平與腫瘤的增殖和進展有關，血漿circ_ABCC1 低表達與腫瘤TNM 分期晚、腫瘤數目多以及淋巴結轉移和遠處轉移相關［36］。外泌體circ_0004771 在CRC 患者血清中的表達升高是由腫瘤引起的。循環外泌體circ_0004771 的表達水平與患者TNM 分期和遠處轉移顯著相關，circ_0004771高表達預示著CRC 患者預后不良［38］。血漿中異常表達的circ_0082182、circ_0000370 與淋巴結轉移關系密切，而circ_0035445 表達與TNM 分期密切相關。此外，circ_0082182和circ_0035445表達水平在術前、術后存在顯著性差異［39］。說明血漿中這3 種異常表達的circRNAs與CRC患者預后有關。

7.3 治療靶點 研究發現circ_ABCC1在CRC外泌體中表達上調，促進CRC 的發生及轉移。進一步研究發現，這種促癌作用與Wnt/β-catenin 通路的激活有關，提示 circ_ABCC1 可能是 CRC 治療的靶點［37］。circVAPA 在組織及血漿中表達均上調，ROC 曲線提示其具有較高的診斷價值，此外，研究發現circVA‐PA的促癌作用可能與其海綿作用有關，它能與致癌通路相關的miR-101 結合，miR-101 過表達與circ-VAPA 沉默具有類似的抑癌作用，circVAPA 過表達引起的促癌作用可通過上調miR-101 表達來逆轉［40］。說明circVAPA可能成為CRC的治療靶點。

8 總結與展望

血液是臨床診斷中最常用的標本，因其具有簡單、快速、無侵襲性等優點，許多研究關注于循環生物標志物的識別。circRNA 具有特殊的結構和特性，有望成為新的生物學標志物，目前已在消化系統腫瘤患者血液中檢測到了不少circRNAs 穩定存在，并與腫瘤發生發展有關，這為消化系統腫瘤早期診斷和預后評估提供非侵入性生物標志物，為靶向治療提供精準靶點。但目前研究處于初級階段，許多問題有待解決，例如血液中circRNAs 來源較廣，無法明確檢測到circRNAs 是否為來源于腫瘤，實驗結果的準確性有待驗證；其次血液標本的質量受諸多因素影響，需要排除（飲食、運動等）外界因素引起circRNAs 含量的異常；此外，有些消化系統腫瘤的作用機制仍不明確，需進一步探索。本課題組相信通過臨床醫務人員以及科研人員的不斷努力，未來有望將circRNAs 作為非侵入性生物標志物用于腫瘤臨床，以及為腫瘤提供精準的治療。