一株針對豬繁殖與呼吸綜合征病毒NADC30-like毒株GP5蛋白的單克隆抗體制備及鑒定

秦義嫻，劉 丹，鄧 永，高金源，蘇 佳，朱 真，吳華偉

(中國獸醫藥品監察所，北京100081)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的豬的一種以母豬繁殖障礙及仔豬出現嚴重呼吸道癥狀的疾病[1]。該病毒于1991年由荷蘭學者首先分離報道[2]。我國于1996年首次分離出病原[3]，并在2006年爆發了由 PRRSV經典毒株突變株引起的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征，2012年以來PRRSV NADC30-like毒株已逐步成為我國的PRRSV優勢流行毒株。

精準診斷是防控PRRS的基礎。國內外已建立了許多可鑒別診斷PRRSV NADC30-like毒株的檢測試劑，絕大多數為RT-PCR方法[4]，但尚未有可特異性用于PRRSV NADC30-like毒株鑒定用單克隆抗體的報道。GP5蛋白作為PRRSV毒的主要糖基化結構蛋白，可誘導機體產生中和抗體，常用于單克隆抗體制備和診斷試劑研制的靶標。本研究以原核表達純化的GP5蛋白[5]作為抗原免疫小鼠，通過間接免疫熒光篩選，獲得1株針對PRRSV NADC30-like毒株GP5蛋白的單克隆抗體，為PRRSV NADC30-like診斷試劑的研制提供了堅實基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、毒株、GP5蛋白及實驗動物 SP2/0細胞、Marc-145細胞、PRRSV 46D(NADC30-like毒株)、PRRSV 30D(NADC30-like毒株)、豬瘟病毒(CSFV)、豬圓環病毒2型 (PCV2)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)，由中國獸醫藥品監察所保存；PRRSV CH-1R株、TJM-F92株、HuN4-F112株、GDr180株、R98株、JXA1-R株均為商品化疫苗；GP5蛋白由中國獸醫藥品監察所制備保存；8周齡Balb/c雌性小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 主要試劑 Protein Marker購于TaKaRa公司； SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購于碧云天生物技術有限公司； HRP標記的羊抗鼠IgG為Invitrogen公司產品；FITC標記的山羊抗小鼠IgG為Sigma公司產品；Mouse單克隆抗體亞型鑒定試劑盒為proteintech公司產品；QuickAntibody-Mouse3 W佐劑為北京博奧龍免疫技術有限公司產品。

1.3 動物免疫 將GP5蛋白與QuickAntibody-Mouse3 W佐劑等體積混勻，通過后腿肌肉注射免疫小鼠，每只小鼠注射100 μL，此后第14天按相同劑量、相同途徑加強免疫，共免疫2次。融合前3日使用200 μL抗原加強免疫一次。

1.4 細胞融合及篩選 無菌條件下取免疫小鼠的脾細胞，與處于對數生長期的SP2/0細胞采用常規方法(50% PEG法)進行細胞融合，并將融合的細胞分置于96孔板中，放置于37 ℃、5% CO2培養箱內培養。10 d后收集雜交瘤細胞上清采用間接免疫熒光方法(IFA)進行檢測，具體方法如下：將處于對數生長期的Marc-145細胞消化后分散至96孔細胞培養板，長成良好單層后(24 h左右)加入PRRSV 46D，每孔100 μL，放置于37 ℃、5% CO2培養箱內繼續培養。當細胞出現30%～50%病變時，加入預冷的無水乙醇4 ℃固定細胞。每孔加入50 μL雜交瘤細胞上清，37 ℃作用1 h，PBS洗3次，加入1∶100稀釋的FITC標記的山羊抗小鼠IgG，37 ℃作用1 h，PBS洗滌3次。熒光顯微鏡下觀察結果。將篩選出來的陽性雜交瘤細胞，按有限稀釋法進行亞克隆，連續克隆3次獲得穩定分泌抗體的雜交瘤細胞株。

1.5 雜交瘤細胞的鑒定

1.5.1 效價測定 用PBS將雜交瘤細胞上清分別稀釋為1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160后按照1.4項間接免疫熒光方法進行檢測，可觀察到特異性熒光的最高稀釋度即為雜交瘤細胞上清的效價。

1.5.2 類及亞類的鑒定 采用單克隆抗體亞型鑒定試劑盒測定單克隆抗體類及亞類，操作方法按試劑盒說明書進行，OD值最高孔對應的即為相應亞型。

1.5.3 穩定性檢測 將雜交瘤細胞株體外連續培養20代，分別取其第5、10、15和20代細胞上清，按照1.4間接免疫熒光方法測定效價。

1.5.4 Western blot鑒定 將GP5蛋白經SDS-PAGE后進行Western blot，一抗采用1∶5稀釋的雜交瘤細胞上清，二抗采用工作濃度的HRP標記的羊抗鼠IgG。以經誘導的pCold-TF空載體作為對照。

1.6 單克隆抗體的制備 鼠腹腔注射液體石蠟致敏，每只0.5 mL。7 d后經腹腔注射雜交瘤細胞，將雜交瘤細胞濃度調整為2×106/mL，每只小鼠注射0.5 mL。待小鼠腹腔膨大時，收取腹水，4 ℃ 9500 r/min離心10 min，收集上清液，即為單克隆抗體。

1.7 單克隆抗體的純化與鑒定

1.7.1 單克隆抗體的純化 采用HiTrap MabSelect親和純化對腹水進行純化，具體方法如下：將腹水4 ℃ 10000 r/min 離心10 min，取上清，用小型濾器過濾后置于冰上；將樣品用冰冷的20 mmol/L PB 3 mol/L NaCl pH7.4溶液稀釋5倍；用冰冷的20 mmol/L PB 3 mol/L NaCl pH7.4溶液平衡5 mL的HiTrap MabSelect親和純化親和柱10個柱體積；將25 mL稀釋樣品上柱結合；上樣完畢用冰冷的20 mmol/L PB 3 mol/L NaCl pH7.4溶液平衡2.5 mL的HiTrap MabSelect親和純化親和柱10個柱體積；用200 mmol/L甘氨酸緩沖液，pH3.0溶液洗脫，收集完畢，立即加入調節溶液300 μL，輕輕混勻；收集完畢后，用冰冷的20 mmol/L PB 3 mol/L NaCl pH7.4溶液平衡HiTrap MabSelect親和柱10個柱體積；收集的組分用SDS-PAGE檢測。

1.7.2 濃度鑒定 采用紫外分光光度計測定純化后的單克隆抗體濃度。

1.7.3 效價測定 用PBS將單克隆抗體稀釋為1∶20、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600后按照1.4項間接免疫熒光方法進行檢測，可觀察到特異性熒光的最高稀釋度即為單克隆抗體的效價。

1.7.4 特異性檢測 取PRRSV活疫苗CH-1R株、R98株、GDr180株、HuN4-F112株、JXA1-R株、TJM-F92株、PRRSV 46D和PRRSV30D分別接種已長成良好單層的Marc-145細胞，待細胞出現30%～50%病變時使用預冷的無水乙醇進行固定，按1.4方法進行單克隆抗體的特異性檢測。將CSFV、PCV2接種PK15細胞，將BVDV接種MDBK細胞后，37 ℃、5% CO2條件下培養72 h，經預冷的無水乙醇固定細胞后按1.4方法進行單克隆抗體的特異性檢測。

2 結果與分析

2.1 雜交瘤細胞株的建立及鑒定 采用純化的GP5重組蛋白免疫8周齡Balb/c雌性小鼠，免疫3次后無菌采集小鼠的脾細胞，與處于對數生長期的S/P20細胞融合，通過間接免疫熒光方法篩選到1株針對GP5蛋白的雜交瘤細胞株，命名為3E10(圖1)。對3E10按有限稀釋法進行亞克隆，連續克隆3次獲得穩定分泌抗體的雜交瘤細胞株。

1. 3E10雜交瘤細胞上清；2. 正常細胞對照

2.2 類及亞類的鑒定 采用Mouse單克隆抗體亞型鑒定試劑盒對3E10雜交瘤細胞進行鑒定，結果顯示重鏈類型為IgM，輕鏈類型為Kappa(表1)。

表1 ELISA法測定單克隆抗體類及亞類

2.3 效價測定 將3E10雜交瘤細胞上清進行1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160稀釋后按照1.4項間接免疫熒光方法進行檢測。結果1∶10、1∶20、1∶40均可觀察到特異性熒光，3E10雜交瘤細胞上清效價為1∶40。

2.4 穩定性檢測 使用間接免疫熒光方法對5代、10代、15代、20代雜交瘤細胞上清進行檢測，結果效價均不低于1∶40，表明已獲得能夠穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。

2.5 Western blot鑒定 圖2結果顯示，3E10可與純化的pCold-TF-GP5發生特異性結合，在72 ku的位置上出現特異性條帶，陰性對照沒有條帶出現，這進一步表明單抗是針對GP5蛋白。

M.蛋白分子質量標準；1.誘導的pCold-TF空載體；2. GP5蛋白

2.6 腹水的純化 待小鼠腹腔膨大時采集腹水，采集三次后對小鼠安樂死處死。將三次采集的腹水混合后采用HiTrap MabSelect親和純化方法進行純化，SDS-PAGE檢測結果表明單抗由2條清晰的帶(輕鏈、重鏈各1條)組成，而無其他雜帶(圖3)。

M. 蛋白分子質量標準; 1. 純化的3E10單克隆抗體

2.7 腹水濃度及效價的測定 采用紫外分光光度計檢測抗體純度為0.204 mg/mL。將單克隆抗體進行系列稀釋后進行間接免疫熒光檢測，結果表明單克隆抗體效價為1∶200。

2.8 單克隆抗體的特異性檢測 圖4結果表明，3E10僅與PRRSV 46D、PRRSV30D反應，與PRRSV CH-1R株、R98株、GDr180株、HuN4-F112株、JXA1-R株、TJM-F92株其他分離株無熒光反應，與CSFV、PCV2、BVDV及正常Marc-145細胞無熒光反應。

A.PRRSV 46D; B.PRRSV 30D; C. CH-1R; D. R98; E.GDr180; F. HuN4-F92;G. JXA1-R; H. TJM-F92; I. Normal Marc-145 cell

3 討 論

目前PRRSV的診斷有間接免疫熒光、免疫組化、RT-PCR等方法，通常采用RT-PCR方法用于PRRSV經典株、高致病性毒株和NADC30-like毒株的鑒別檢驗[4]。相較于其他方法，間接免疫熒光方法具有操作簡單、準確性高、特異性好的特點。此外，基于GP5蛋白的單抗也有用于中和試驗的價值，國內已有成功制備具有中和活性IgM亞類單抗的報道[6]。本研究制備的3E10單克隆抗體，亞類鑒定為IgM，效價僅為1∶200，可能與純化的方式不合適、腹水濃度較低有關。IgM抗體以五聚體結構存在，純化難度極大，需要結合鹽析及IEC或者SEC的多步操作，不僅繁瑣且預期產量低。據報道，采用蛋白質L親和層析和山羊抗鼠IgM抗體親和層析效果較好[7]，可以作為下一步3E10單克隆抗體純化的參考。

PRRSV極易變異，這給該病防控工作帶來了挑戰。自1996年郭寶清等首次從我國分離到PRRSV[3]，該病毒在我國已存在二十余年。根據田間自然分離株的基因組及致病性特征，可人為地將我國PRRS的流行大致分為三個階段：第一個階段為經典毒株流行階段，第二個階段為高致病性變異株的流行階段，第三個階段為NADC30-like毒株的流行[8]。自2012年周峰等[9]首次發現并報道NADC30-like毒株以來，該病毒已在我國豬群內廣泛傳播。通過對GP5氨基酸序列進行比對發現，NADC30-like毒株與經典PRRSV、高致病性PRRSV的氨基酸同源性較低，分別為83.6%～84.9%、83.6%～86.6%[10]，比較適合用于PRRSV鑒別用單克隆抗體制備用免疫原。本研究采用純化表達的PRRSV NADC30-like毒株GP5，成功篩選出一株可有效區分PRRSV NADC30-like毒株與經典株的單克隆抗體，證明了采用GP5蛋白用于PRRSV鑒別用單克隆抗體制備的可行性，也為下一步建立區分類NADC30毒株與經典株和變異株的診斷試劑奠定了基礎。