表達紅色熒光蛋白的重組鴨腸炎病毒的構建及鑒定

苗清新,宋亞芬，王靜文，張 兵，張 敏，楊承槐

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

鴨腸炎病毒(Duck enteritis virus，DEV)又稱鴨瘟病毒，可引起鴨病毒性腸炎，是一種泛嗜性全身性感染的病毒，也是危害養鴨業最為嚴重的病原之一[1]。該病毒對不同品種、年齡的鴨均可致病。患病鴨臨床表現為急性敗血癥過程，其特征是血管損傷，體腔溢血，消化道出血、炎癥和壞死等。

DEV屬于皰疹病毒科馬立克病毒屬，具有基因組大、非必需基因多、遺傳穩定性好等特性[2-4]。這些特性使DEV作為病毒載體成為可能。以DEV為載體，已成功表達了小鵝瘟病毒VP2 基因[5]、新城疫病毒F基因[6]、H5N1型高致病性禽流感病毒HA基因[7]。在DEV基因組中插入報告基因可快速高效地篩選重組病毒。目前常用綠色熒光蛋白(GFP)、增強型綠色熒光蛋白(EGFP)、紅色熒光蛋白(RFP)以及β-半乳糖苷酶基因(LacZ)標記重組病毒。

孫瑩等[8]通過同源重組將GFP表達盒插入DEV UL2 基因，篩選并純化了表達綠色熒光蛋白的UL2基因缺失的重組DEV。但研究發現GFP在DEV中不能穩定表達，隨著重組病毒的不斷傳代，GFP會發生點突變或缺失[1]，因此有必要篩選更加穩定的報告基團。

本研究將帶有RFP的UL2基因缺失轉移載體pT-UL2-RFP與DEV共轉染雞胚成纖維細胞(Chicken embryo fibroblast, CEF)，經過5輪蝕斑篩選、純化，獲得表達RFP的重組DEV，通過測定重組病毒及其親本毒的一步生長曲線以及用PCR測定不同代次重組病毒的RFP序列，以期獲得更穩定的報告基因，為后期重組病毒的篩選奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要試劑 限制性內切酶、T4 DNA 連接酶購自北京NEB公司；Ex Taq DNA 聚合酶購自大連TaKaRa公司；膠回收試劑盒、質粒小提中量試劑盒等均購自天根生化科技(北京)有限公司；胎牛血清、M199培養液購自Hyclone公司；OPTI-MEM培養液購自Gibco公司；7.5% NaHCO3購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

1.1.2 菌(毒)株與細胞 DEV細胞適應毒以及重組質粒pT-UL2-GFP-gpt[9]、pT-RFP由中國獸醫藥品監察所菌種保藏與檢測室構建、保存；DH5α受體菌購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3 SPF雞胚 購自北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司。

1.1.4 鑒定引物 ORFC17F：5’-ATGGCCGACG-ATAGGCT-3’，ORFC17R：5’- TTATACTGTTCCACAAGG -3’，由賽默飛世爾科技公司(Thermo Fisher Scientific)合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 重組質粒pT-UL2-RFP構建 重組質粒pT-UL2-GFP-gpt用限制性內切酶NheI-HF、BamH I-HF雙酶切，切除重組質粒GFP-gpt表達盒，回收6.2 kb片段，質粒pT-RFPNX用限制性內切酶NheI-HF、BamH I-HF雙酶切，回收大小為711 bp RFP片段，通過T4 DNA連接酶將RFP替換GFP-gpt，構建重組質粒pT-UL2-RFP。

1.2.2 重組病毒的制備、純化 DEV細胞適應毒接種CEF(MOI=0.01)，吸附1～2 h后，按Lipofectamine 3000說明書轉染高純度質粒pT-UL2-RFP。轉染后72～96 h，觀察細胞病變情況，待80%細胞產生病變后，反復凍融3次，接種于新鮮CEF單層的六孔培養板中，用含5%血清、1%雙抗、1%瓊脂的M199培養液覆蓋，37 ℃、5% CO2培養箱中培養48～72 h。觀察熒光，挑取單個有紅色熒光的蝕斑，在細胞上重復多次傳代，直至所有的蝕斑都帶有紅色熒光，確定為純化的重組病毒。

1.2.3 重組病毒基因組DNA的提取 取重組DEV病毒液437.5 μL，加入蛋白酶K(20 mg/mL)12.5 μL，10% SDS 50 μL；56 ℃水浴1 h；分別用酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)、氯仿各抽提一次；取上清，加入1/10體積3 mol/L醋酸鈉和兩倍體積的無水乙醇，-20 ℃放置30 min；12000 g離心10 min，去除上清后，70%乙醇洗滌沉淀一次，沉淀溶于30 μL去離子水中，-20 ℃保存備用。

1.2.4 重組病毒鑒定 重組病毒DNA用鑒定引物ORFC17F、ORFC17R進行PCR擴增， PCR產物送北京華大基因生物公司測序。

1.2.5 一步生長曲線 將重組病毒及其親本毒分別接種于8瓶25 cm2(MOI=0.01)的CEF中，接種后每隔12 h取出一瓶接毒細胞，收集細胞培養液上清作為上清樣品，再加入1 mL含有1% FBS的M199細胞維持液，凍融后取上清作為細胞樣品。將重組病毒及親本毒的病毒懸液做10倍系列稀釋，取4個適宜稀釋度，接種新鮮的CEF單層96孔細胞培養板，每孔接0.1 mL，每個稀釋度接5孔，37 ℃吸附1 h后每孔加入0.1 mL細胞維持液，37 ℃、5% CO2培養箱中培養5 d。觀察致細胞病變效應(Cytopathic Effect，CPE)，記錄每個稀釋度出現CPE的孔數，按Reed-Muench法計算病毒TCID50，并繪制一步生長曲線。

1.2.6 重組病毒的穩定性 將重組病毒接種CEF(MOI=0.01)，待80%細胞產生病變后，反復凍融3次，再接種CEF，按此方法連續傳代12次。熒光顯微鏡下觀察每代重組病毒的紅色熒光表達情況。按1.2.3 方法提取第5代、第10代、第12代病毒DNA，用鑒定引物ORFC17F、ORFC17R 通過PCR鑒定外源基因RFP是否穩定存在。PCR產物送北京華大基因公司進行測序。

2 結果與分析

2.1 重組質粒pT-UL2-RFP的酶切鑒定 重組質粒pT-UL2-RFP用限制性內切酶NheI-HF以及BamH I-HF雙酶切鑒定，得到大小約為6.2 kb和771 bp的兩個片段(圖1)，符合理論值。

M: D5000; 1: 重組質粒pT-UL2-RFP的雙酶切

2.2 重組病毒的制備、純化和鑒定

2.2.1 重組病毒的篩選 用質粒小提中量試劑盒提取高純度轉移載體質粒pT-UL2-RFP，將質粒濃縮為1 μg/μL后，將該轉移質粒載體與DEV共轉染CEF，24 h后，即可在熒光顯微鏡下觀察到帶有紅色熒光的的梭形細胞，說明質粒在該細胞中表達，待80%細胞產生病變后，收獲細胞并反復凍融3次，將其接種到長有新鮮CEF單層的六孔培養板中，用含5%血清、3% NaHCO3、1%雙抗、1%瓊脂的M199培養液覆蓋，觀察熒光，挑取單個有紅色熒光的蝕斑，再接種到新的細胞上，經過5輪篩選，所有的蝕斑都帶有紅色熒光，獲得純化的重組病毒(圖2)。

圖2 表達紅色熒光的重組DEV病毒

2.2.2 重組病毒的鑒定 用鑒定引物ORFC17F/ORFC17R對重組病毒進行PCR擴增鑒定，得到大小約為2000 bp的片段(圖3)，與理論值相符。

M: D5000; 1: 重組DEV病毒PCR鑒定產物

將PCR產物送北京華大基因生物公司測序，結果顯示重組病毒缺失UL2基因，且帶有RFP標記基團。

2.3 一步生長曲線 繪制重組病毒及其親本毒的一步生長曲線。圖4結果表明，親本毒接種CEF后48 h，病毒含量達到峰值106.5TCID50/0.1 mL，84 h上清樣品病毒含量達到峰值106.75TCID50/0.1 mL。而表達紅色熒光蛋白的重組病毒細胞的病毒含量在48 h達到峰值，為106.4TCID50/0.1 mL，上清樣品的病毒含量在84 h達到峰值，為106.83TCID50/0.1 mL，與親本毒無差異(P>0.05)。

圖4 重組病毒rDEV-ΔUL2-RFP的一步生長曲線

2.4 重組病毒的傳代穩定性 重組病毒經傳代12次，熒光顯微鏡下觀察紅色熒光在1～12代均可穩定表達，所有產生CPE的細胞均帶有紅色熒光(圖5)。重組病毒第5代、第10代、第12代PCR均擴增出2000 bp片段(圖6)。測序結果表明，RFP序列未出現變異。

圖5 重組病毒的傳代穩定性檢測

M:D5000; 1：重組病毒第5代擴增片段；2：重組病毒第10代擴增片段；3：重組病毒第12代擴增片段

3 討論與結論

本研究篩選并純化了表達RFP的UL2基因功能缺失的重組鴨腸炎病毒，并對其生物學進行初步研究。研究表明該重組病毒的生長特性與親本毒相似，并且可在CEF上連續穩定傳代。與GFP相比，RFP在DEV中更穩定，至少在UL2基因內，RFP更適合重組DEV的反向篩選。

傳統同源重組技術常以GFP、RFP、LacZ等作為重組病毒篩選標記基團，LacZ作為標記基團其缺點是分子量較大，不便于啟動子克隆時重組質粒的構建，通過化學顯色，檢測靈敏度低，操作繁瑣；熒光蛋白如GFP、RFP分子量小，發光強，操作簡單，可直接在熒光顯微鏡下觀察，易于檢測，對基因功能、蛋白表達、定位示蹤等諸多研究發揮了重要作用[10-11]。但是目前已有研究表明，GFP在重組病毒中不穩定，隨著傳代次數的增加易發生點突變或缺失[1]，Fang等[12]構建表達GFP的北美1型豬繁殖與呼吸綜合征的感染性克隆，拯救出含有GFP的病毒粒子，當病毒連續傳代至第7代時，發現GFP基因發生突變；孫瑩等[1]研究顯示表達GFP的重組鴨瘟病毒，綠色熒光在1～5代可以穩定表達，從第6代開始可觀察到少量沒有熒光的細胞病變，15～20代絕大部分細胞病變無綠色熒光，對重組DEV的篩選帶來極大困難。紅色熒光蛋白(RFP)出現較GFP稍晚，其可以激發和發射波長段也不同。本研究將RFP替代GFP，獲得了一株表達紅色熒光的重組DEV，且一步生長曲線表明RFP對DEV的生長無影響； RFP連續傳代12代，能夠穩定表達且無突變。試驗證明RFP穩定性更強，與研究報道一致[13-14]。根據本實驗室在重組DEV 篩選方面的經驗，通常在10代以內就能夠克隆純化到重組病毒，因此本研究僅將RFP連續傳代至12代，未進行更多的傳代。本研究結果對重組DEV的構建、篩選具有很好的借鑒意義。