農業執法案件中未知粉末的分析研究

熊 玥，鄭勝蘭，尹原妍，吳 玲，劉建暉*，陳慧敏

(1.江蘇省獸藥飼料質量檢驗所，南京 210036；2.上海愛博才思分析儀器貿易有限公司，上海 200335)

近年來，由于養殖環節濫用獸藥或飼料添加劑甚至違規使用禁用物質從而導致的食品安全問題時有報道，引起了人們的廣泛關注[1-2]。對于此類違法行為，農業農村部始終保持高壓嚴打態勢，不斷更新發布相關的檢驗方法[3-5]。然而不法分子受到利益驅使，在獸藥或飼料中濫用其注冊配方以外的非法添加物，手段新奇多樣，種類頻頻更換。更有甚者直接將無生產許可證、無質量檢驗合格證、無產品標簽的“三無”產品作為“秘方”銷售給養殖戶使用。對此，只有摸清產品中違規添加物的種類及其危害，才能有的放矢的制定相關國家標準，以滿足監管需求。

目前，對于此類違規添加物的篩查主要基于兩種模式。第一種是通過走訪、調研、訊問后對樣品進行研判，從而得到化合物的準確信息；如果未能獲得有效信息，可利用高效液相色譜-二極管陣列檢測(HPLC-PDA)法、超高效液相色譜-質譜(UPLC-MS)法、氣相色譜-質譜(GC-MS)法等收集樣品的信息，并將數據與已錄入譜庫的化合物進行比較，篩出疑似化合物種類。以上均可稱為靶向篩查，得到目標化合物后，設計合理的實驗方案確證即可[6-7]。對于既無法獲取確切信息又不在譜庫中的未知物，其篩查鑒定主要依靠非靶向篩查模式，常借助高分辨質譜(HRMS)的全質量數采集功能，提取感興趣的色譜峰，獲得其精確質荷比及天然同位素分布；然后利用軟件進行分子式擬合；最后通過高質量二級碎片信息進行結構解析，推測未知物的主要官能團和裂解途徑，從而組成未知物的結構，再通過質譜、紫外光譜、紅外光譜、核磁共振等方法進行多重確證[8-9]。

本研究先后應用靶向及非靶向篩查技術對養殖環節中查獲的“三無”產品進行了未知物的分析，通過超高壓液相色譜-飛行時間高分辨質譜(UPLC-TOF-HRMS)采集的數據，推導出疑似化合物結構式；并采用HPLC-PDA法與UPLC-TOF-HRMS法對篩查發現的兩種化合物進行了雙重確證，以期為農業執法提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器 LC-30A 超高效液相色譜儀(日本SHIMADZU公司)- Triple TOF 4600 飛行時間高分辨質譜儀配PeakView及MasterView軟件(美國SCIEX公司)； ACQUITY Arc高效液相色譜儀配2998二極管陣列檢測器及Empower 3工作站(美國Waters公司)；XS205DU分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)。

1.2 藥品與試劑 待測未知粉末為某市公安分局涉農案件查處過程中繳獲的“三無”產品(性狀：灰黃色粉末)。鹽酸克侖特羅對照品購自中國食品藥品檢定研究院(批號100072-201503；按克侖特羅(C12H18Cl2N2O)計，含量為90.5%)；鹽酸克侖特羅雜質B對照品購自EDQM(批號C2248010；含量為100.0%)。甲醇、乙腈、甲酸為色譜純(美國MERCK公司)；所用水為超純水。

1.3 溶液的制備

1.3.1 供試品溶液的制備 取未知粉末約0.5 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理10 min，冷卻至室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取濾液作為HPLC-PDA供試品確證溶液。精密量取HPLC-PDA供試品確證溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇-水(1∶9，V/V)溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，取濾液作為UPLC-TOF-HRMS供試品初篩及確證溶液。

1.3.2 對照品溶液的制備 取鹽酸克侖特羅及鹽酸克侖特羅雜質B對照品各約10 mg，精密稱定，分別置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；用甲醇-水(1∶1，V/V)溶液稀釋制成每1 mL含50 μg的溶液，搖勻，作為HPLC-PDA對照品確證溶液。用甲醇-水(1∶9，V/V)溶液將HPLC-PDA對照品確證溶液稀釋制成每1 mL含100 ng的溶液，搖勻，作為UPLC-TOF-HRMS對照品確證溶液。

1.4 儀器條件

1.4.1 UPLC-TOF-HRMS法條件 ACQUITY UPLC HSS T3 C18色譜柱(100 mm × 2.1 mm，1.7 μm)；柱溫：40 ℃；進樣體積：5 μL；流速：0.3 mL/min；流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫：0～1.0 min，保持98% A；1.0～8.0 min，98% A～55% A；8.0～10.0 min，55% A～2% A；10.0～12.0 min，保持2% A；12.0～12.1 min，2% A～98% A；12.1～16 min，保持98% A。采用ESI離子源，在正離子模式下采集數據，電噴霧電壓為5500 V，離子源溫度為500 ℃，霧化氣(氮氣)壓力為344.75 kPa(50 psi)，輔助霧化氣(氮氣)壓力為344.75 kPa(50 psi)，氣簾氣(氮氣)壓力為172.37 kPa(25 psi)；一級質譜掃描范圍為50～1000 Da，去簇電壓為60 V；碰撞能量為10 eV；二級質譜掃描范圍為40～1000 Da，去簇電壓為60 V，碰撞能量(CE)為35 eV，碰撞電壓擴展能量(CES)為15 eV；開啟動態背景扣除(DBS)。

1.4.2 HPLC-PDA法條件 XBridge C18色譜柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；進樣體積：10 μL；流速：1.0 mL/min；流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫：0～10.0 min，95% A～40% A；10.0～11.0 min，40% A～95% A；11.0～16 min，保持95% A。二極管陣列檢測器，采集波長范圍190 nm～400 nm，分辨率1.2 nm，記錄276 nm波長處的色譜圖。

2 結果與分析

2.1 “三無”產品中未知物的發現與初步分析 按1.4.1項條件采集正離子模式下UPLC-TOF-HRMS供試品初篩溶液的色譜圖，對總離子流圖進行基峰提取(即把一段時間內響應比較高的信號提取出來，簡稱BPC)，可見保留時間6.50 min(未知物1)及6.69 min(未知物2)處有較強響應(圖1)。借助MasterView軟件與自建化合物譜庫(主要為常見獸藥及養殖禁用藥物)進行檢索，并使用PeakView軟件對分子式進行擬合，參考文獻報道推導未知物結構。

圖1 UPLC-TOF-HRMS供試品初篩溶液正離子模式下的BPC圖

2.1.1 未知物2結構式的分析推測 保留時間6.69 min的未知物2，精確質荷比為277.0870(圖2)，其母離子裂解產生m/z259.0761、203.0135、168.0443、132.0670、57.0693的二級特征碎片離子(圖3)，與譜庫中化合物克侖特羅的二級碎片匹配度高達99.2%。其母離子精確質量數與克侖特羅的理論質量數(m/z為277.0869)偏差僅為0.2×10-6，天然同位素匹配度高，二級碎片與文獻報道中克侖特羅的裂解碎片一致[10-11](圖4)。結合該產品最終將用于養殖環節等信息，推測未知物2為養殖禁用藥物“瘦肉精”克侖特羅。

圖2 未知物2色譜峰的精確質量數及同位素分布圖

圖3 未知物2(虛線之上)與譜庫中克侖特羅(虛線之下)的二級碎片匹配結果圖

圖4 文獻報道的克侖特羅裂解途徑

2.1.2 未知物1結構式的分析推測 保留時間6.50 min的未知物1，精確質荷比為275.0716(圖5)，借助PeakView軟件中的分子式擬合功能對其分子式進行預測，結合其母離子的同位素豐度比(圖5)，元素組成設置為有機物常見的C、H、O、N、S、P、F、Cl、Br，允許誤差范圍設置為5×10-6，軟件計算給出質量數偏差最小結果為C12H16Cl2N2O(m/z為275.0712)，質量相對誤差1.3×10-6，同位素匹配(圖5、表1)，該分子式相較于克侖特羅分子式少2個H。該峰主要二級碎片m/z200.9978推測分子式為C8H7Cl2N2、m/z166.0291推測分子式為C8H7ClN2(圖6)，均比克侖特羅主要二級碎片分子式C8H9Cl2N2、C8H9ClN2少2個H，推測該未知化合物與克侖特羅結構相似，可能為其類似物。排名第二的預測分子式C9H17N2O2FCl2，其不飽和度(RDB)僅為1，二級碎片偏差也較大，故未做分析。

表1 軟件推測的未知物1可能的分子式及排名

圖6 未知物1的二級碎片圖

查閱國內外文獻，未發現關于分子式為C12H16Cl2N2O的“瘦肉精”的報道，僅發現在克侖特羅的合成工藝[12]中給出克侖特羅合成中間體為C12H16Cl2N2O(圖7)，該結構式與歐洲藥典(EP)中克侖特羅雜質B相同。克侖特羅與克侖特羅雜質B的主要結構區別為苯乙醇胺部分，羥基變成了酮基(圖8、圖9)。參考克侖特羅裂解途徑，推導出克侖特羅雜質B可能的裂解途徑(圖10)，與未知物1的二級碎片基本吻合，由此推測未知物1為克侖特羅雜質B。

圖7 文獻報道的克侖特羅合成工藝圖

圖8 克侖特羅結構式

圖9 克侖特羅雜質B結構式

圖10 克侖特羅雜質B可能的裂解途徑

2.2 未知物的確證

2.2.1 HPLC-PDA法確證 取HPLC-PDA供試品確證溶液、HPLC-PDA對照品確證溶液，按1.4.2項條件分別進樣。將HPLC-PDA供試品確證溶液色譜圖中未知物1及未知物2的色譜峰分別與HPLC-PDA對照品確證溶液中主峰的保留時間及紫外光譜圖進行比對。在該試驗條件下，HPLC-PDA供試品確證溶液色譜圖中未知物1色譜峰與對照品溶液中克侖特羅雜質B的保留時間一致，紫外光譜無明顯差異；未知物2色譜峰與對照品溶液中克侖特羅對照品的保留時間一致，紫外光譜無明顯差異(圖11、圖12)。依據農業農村部公告第289號《獸藥中非特定非法添加物質檢查方法》液相色譜-二極管陣列法[3]進行結果判定，供試品色譜圖中如出現與對照品峰保留時間一致的色譜峰(差異不大于±5%)；在一定的波長范圍內，兩者光譜圖無明顯差異；最大吸收波長一致(差異不大于±2 nm)，判定該未知粉末中檢出克侖特羅雜質B及克侖特羅。

圖11 HPLC-PDA供試品確證溶液的色譜圖及紫外光譜圖

圖12 對照品溶液中克侖特羅雜質B和克侖特羅的色譜圖及紫外光譜圖

2.2.2 UPLC-TOF-HRMS法確證 在相同條件下，采集克侖特羅雜質B對照品、克侖特羅對照品的二級譜圖并載入軟件譜庫中。使用MasterView軟件進行靶向分析：未知物1與克侖特羅雜質B對照品保留時間一致，母離子精確質量數的實測值與理論計算值偏差為0.8×10-6，二級質譜圖匹配，見圖13；未知物2與克侖特羅對照品保留時間一致，母離子精確質量數的實測值與理論計算值偏差為0.2×10-6，二級質譜圖匹配，見圖3。參照農業農村部公告第289號《獸藥中非特定非法添加物質檢查方法》液相色譜-高分辨質譜法[3]進行結果判定，供試品色譜圖中如出現與對照品峰保留時間一致的色譜峰(保留時間相對偏差不大于2.5%)；供試品與對照品分子離子峰的質量數偏差不大于5×10-6，且二級質譜圖與對照品的二級質譜圖一致，判定該未知粉末中檢出克侖特羅雜質B及克侖特羅。

圖13 未知物1(虛線之上)與譜庫中克侖特羅雜質B(虛線之下)的匹配結果圖

3 討論與結論

3.1 樣品前處理及儀器方法的選擇 對于未知樣品來說，前處理方法是否合適直接關系到化合物的檢出率。HRMS借助超高的分辨率可以區分復雜背景中的雜質及共流出物，降低了對樣品前處理的要求[13]。本樣品加入甲醇超聲后即可全部溶解，為防止出現溶劑效應，本實驗采用了不同比例的甲醇-水溶液作為后續稀釋液。為使不同極性的化合物均有可能分離流出，未知物篩查流動相一般采用有機相由低到高的梯度洗脫。HRMS一般不需要使用對照品來優化儀器參數[13]，SCIEX QTOF系列常采用35±15 eV或者40±20 eV作為未知物篩查時二級質譜采集的CE及CES，該條件下采集的二級裂解碎片基本可以滿足一般化合物的分析需求。

3.2 克侖特羅及克侖特羅雜質B添加原因分析 “瘦肉精”是一類可用來促進動物體肌肉生長、脂肪代謝，增加瘦肉比例的藥物的俗稱[14]，當消費者食用含有“瘦肉精”殘留的動物產品時，會對其心血管和中樞神經系統產生不利影響，嚴重的可引發中毒[15]。我國在2002年就已嚴禁“瘦肉精”作為獸藥和飼料添加劑應用于食品動物的養殖環節[16-17]。但是在利益面前，違法生產銷售使用“瘦肉精”的行為仍然屢禁不止。經HPLC法定量分析，該“三無”產品中約含克侖特羅16 g/kg；約含克侖特羅雜質B 455 g/kg。在養殖環節中檢出克侖特羅雜質B屬于首次報道，其與“瘦肉精”克侖特羅結構相似，目前未查詢到有關克侖特羅雜質B藥理及毒理方面的文獻報道，使用后可能出現不確定的風險，需要引起有關部門的重視。本案結案后，警方反饋，在檢測結果面前，“三無”產品生產商交代，因克侖特羅合成的收率太低，故添加大量克侖特羅合成中間體(即克侖特羅雜質B)進行銷售以降低成本，由此也佐證了研究結果。

3.3 結論與展望 本文介紹了一種使用UPLC-TOF-HRMS對執法送檢樣品進行未知化合物篩查確證的分析研究方法，為案件的偵破提供了強有力的技術支持。HRMS采取的是高分辨率的全掃描數據采集模式，具有掃描速率快、質量范圍寬等特點，生成的文件具有可回顧性，便于對歷史數據進行重新分析。運用高精確分子質量、同位素豐度信息結合軟件的強大計算功能，可進行譜庫檢索、分子式預測及結構解析。因此，應用HRMS技術進行定性篩查己經成為了一種趨勢[18-19]。目前我國瘦肉精監管主要集中在以克侖特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺等[14]為代表的傳統“瘦肉精”，不法商販為了逃避監管和處罰，近幾年衍生出了苯乙醇胺A、賽庚啶等許多新型“瘦肉精”藥物[20]，隱蔽性更高，安全隱患更大，給“瘦肉精”的監管帶來了極大的挑戰。因此提高“瘦肉精”、尤其是新型“瘦肉精”及其他用于養殖環節中的違規添加物的檢測技術，刻不容緩。