林可霉素注射液非法添加鹽酸左旋咪唑的HPLC檢測方法研究

鄭 潔，劉雪紅，陳 玲

(大連市檢驗檢測認證技術服務中心，遼寧大連 116037)

鹽酸左旋咪唑(levamisole hydrochloride)，是一種廣譜抗線蟲藥，對馬、牛、綿羊、豬、犬和雞的大多數線蟲具有活性，還能明顯提高免疫反應。在獸醫臨床上用作牛、羊、豬、犬、貓和禽的胃腸道線蟲、肺線蟲以及犬心絲蟲和豬腎蟲感染的治療，也用于免疫功能低下動物的輔助治療和提高疫苗免疫效果[1]。但該藥具有潛在的基因毒性，攝入過量對皮膚、神經、消化、心血管、免疫等多個系統造成損害，導致癌變、畸變，甚至死亡[2]。獸醫臨床使用劑量為每日7.5 mg/kg，禽類為每日7.5 mg/kg。國內對肉源性組織和生鮮乳中左旋咪唑殘留已經發布了相關標準[3-4]，但飼料和獸藥中非法添加左旋咪唑還缺少相關的檢驗標準，導致檢出左旋咪唑而無法判定的情況。在2020年獸藥檢測過程中，按照《農業農村部公告169號》[5]篩查后，就發現一例林可霉素注射液中非法添加鹽酸左旋咪唑的案例，針對出現的左旋咪唑添加物，開展方法學研究，建立林可霉素注射液非法添加鹽酸左旋咪唑的HPLC檢測方法，以期對林可霉素注射液質量控制和左旋咪唑的相關檢測標準的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 Levamisole Hydrochloride(99.9%, TMstandard)；甲醇(色譜純，天津市科密歐化學試劑)；磷酸二氫鈉(分析純，天津市科密歐化學試劑)；三乙胺(分析純，天津市科密歐化學試劑)；氫氧化鈉(分析純，天津市科密歐化學試劑)；鹽酸林可霉素注射液(10 mL:0.3 g)：四川顯華動物藥業有限公司，經檢測不含鹽酸左旋咪唑。

1.1.2 儀器設備 BS21S電子天平(Sartorius)；2695高效液相色譜儀(Waters)；2998二極管陣列檢測器(Waters)；超聲波清洗機(上海科導超聲儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 Waters Atlantis?T3 C18色譜柱(4.6×250 mm,5 μm)；流動相：磷酸二氫鈉溶液(取磷酸二氫鈉3.0 g，加水1000 mL，加三乙胺0.5 mL，用飽和氫氧化鈉溶液調節pH值至7.0)-甲醇(70∶30)；流速1.00 mL/min；柱溫30.0 ℃；檢測波長230 nm；進樣體積10.0 μL。

1.2.2 供試品溶液的制備 溶劑空白溶液的制備:取甲醇試劑，過濾后作為溶劑空白溶液。對照品溶液的制備:精密稱取鹽酸左旋咪唑對照品適量，用甲醇溶解并稀釋成0.1 mg/mL的溶液。樣品空白溶液的制備:精密量取不含鹽酸左旋咪唑的鹽酸林可霉素注射液1 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取1 mL，置25 mL容量瓶中, 加甲醇稀釋至0.024 mg/mL的鹽酸林可霉素溶液，作為空白樣品溶液。陽性添加溶液的制備：在林可霉素注射液中添加鹽酸左旋咪唑對照品，用甲醇配制成含鹽酸左旋咪唑0.1 mg/mL的溶液，作為陽性添加溶液。

1.2.3 專屬性 按1.2.1項色譜條件，對1.2.2項中的試劑空白溶液、對照品溶液、樣品空白溶液、陽性添加溶液分別進樣，對色譜圖進行比對。

1.2.4 最低檢測限和定量限 按1.2.1項色譜條件，將對照品溶液逐級稀釋，分別配制成濃度為0.0032、0.0016、0.0008、0.0004、0.0002、0.0001 mg/mL的溶液注入高效液相色譜儀，同時記錄色譜圖及光譜圖。將信噪比大于等于2時對應的濃度定義為最低檢測限，將信噪比大于等于10時對應的濃度定義為定量限。

1.2.5 精密度 采用重復性試驗考察，精密稱取鹽酸左旋咪唑對照品10 mg，定容于100 mL容瓶中，配制成濃度為0.1 mg/mL 鹽酸左旋咪唑對照品溶液，將其重復進樣6次，進樣體積為10.0 μL，記錄色譜圖，計算其峰面積相對標準偏差(RSD)。

1.2.6 線性關系 精密稱取鹽酸左旋咪唑對照品100 mg，置100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，精密量取1、2、3、5、10、20 mL分別置50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾后取精密量取10.0 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按鹽酸左旋咪唑對照品溶液濃度與對應的鹽酸左旋咪唑峰面積作標準曲線，計算回歸方程和相關系數。

1.2.7 回收率 取1 mL鹽酸林可霉素注射液，添加鹽酸左旋咪唑對照品100 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；再精密量取1 mL置25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液，平行配制6份。對照品溶液的配制同1.2.2項。分別精密量取供試品和對照品溶液10.0 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法計算峰面積。

1.2.8 耐用性 考察3個不同的色譜柱(Waters Sunfire?C18 4.6×250 mm, 5 μm、Waters Atlantis?C18 4.6×250 mm, 5 μm、Waters Atlantis?T3 C18 4.6×250 mm, 5 μm)，3個不同的柱溫(20.0、25.0、30.0 ℃)，3個不同的pH值(6.8、7.0、7.2)，流動相甲醇的比例分別為28%、30%、32%時，對峰保留時間、理論板數等方面的影響。

2 結果與分析

2.1 專屬性 結果如圖1所示，對照品溶液和陽性添加溶液在39 min左右出峰，且光譜圖無差異，空白溶劑和鹽酸林可霉素樣品在39 min左右均無色譜峰出現。說明在此色譜條下鹽酸林可霉素不影響酸左旋咪唑的檢測，甲醇溶劑對左旋咪唑的檢測亦沒有干擾。

a.溶劑空白溶液 b. 對照品溶液c. 樣品空白溶液d. 陽性添加溶液

2.2 最低檢測限和定量限 對逐級稀釋后的鹽酸左旋咪唑溶液測定后，結果顯示，鹽酸左旋咪唑濃度為0.0002 mg/mL時信噪比為2.8，濃度為0.0016 mg/mL時信噪比為11.6，所以鹽酸左旋咪唑的最低檢測限為0.0002 mg/mL，定量限為0.0016 mg/mL。

2.3 精密度 對重復性試驗記錄的色譜圖進行處理，計算6次進樣的峰面積RSD為0.6%，表明本方法具有良好的重復性，符合精密度試驗的要求。

2.4 線性關系 將濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.1、0.2、0.4 mg/mL的左旋咪唑溶液色譜圖進行處理，分別計算其峰面積。以鹽酸左旋咪唑濃度為橫坐標x，峰面積(AU)為縱坐標y，繪制標準曲線，其線性回歸方程為y=1.528×107x-14689，R2=0.9999(圖2)。表明鹽酸左旋咪唑在濃度0.02～0.4 mg/mL時，線性關系良好。

圖2 鹽酸左旋咪唑標準曲線

2.5 回收率 將6份添加濃度為0.08 mg/mL的供試品溶液的色譜圖進行處理，分別計算峰面積值，按外標法計算鹽酸左旋咪唑的含量，平均回收率為99.7%，RSD為0.8%。結果見表1。

表1 鹽酸林可霉素注射液中鹽酸左旋咪唑回收率試驗結果(n=6)

2.6 耐用性 試驗結果顯示，使用3種色譜柱分離后結果顯示，T3色譜柱的理論板數和峰形明顯優于其它色譜柱，分析T3色譜柱具有親水性強的特點，當流動相水相占比例較大時，采用此種色譜柱可以有效提高鹽酸左旋咪唑的理論板數；柱溫的升高可以使鹽酸左旋咪唑的保留時間略有提前，但3個柱溫條件下無明顯差異(保留時間差值小于1 min)，柱溫的提高有利于增加鹽溶液的溶解性，提高其流動性、降低流路壓力，但柱溫的設定還需要參考實驗室內的室溫，避免與室溫相差太大；3個pH值條件下，鹽酸左旋咪唑的保留時間差小于1 min、峰面積相對偏差小于1.5%、理論板數相對偏差小于1.5%，均無明顯差異，提示pH的變化對實驗影響不大；流動相中有機相甲醇的比例升高可以縮短目標峰的出峰時間，但由于無機相為鹽溶液，有機相比例的升高會加大色譜柱的柱壓，甚至導致管路堵塞，在有機相甲醇比例為30%以下時，能達到穩定的柱壓，甲醇比例在28%時保留時間較30%時延后，且理論板數降低，說明甲醇比例在30%時系統穩定性和理論板數最好。

供試品溶液色譜圖中如出現與鹽酸左旋咪唑對照品色譜峰保留時間一致的峰(差異小于等于5%)，且為單一物質峰；在200～400 nm范圍波長內，二者紫外光譜圖一致，最大吸收波長無明顯差異(差異小于等于±2 nm)，判為檢出鹽酸左旋咪唑。供試品溶液色譜圖中的峰保留時間與鹽酸左旋咪唑對照品峰相同，但峰面積小于檢測限峰面積，判定為未檢出鹽酸左旋咪唑。

3 討論與結論

3.1 添加目的分析 鹽酸林可霉素臨床用于治療豬痢疾的常用藥物[6]，抗菌譜廣，對敏感葡萄球菌屬、鏈球菌屬、肺炎鏈球菌及一些敏感性厭氧菌所致的呼吸道感染、腸道感染、皮膚軟組織感染都有效果。同時在聯合交叉用藥時，不會產生耐藥性[7]。鹽酸左旋咪唑針對動物腸道球蟲病所致的感染有增效作用[8-9]，還可以提高免疫[10-11]。林可霉素制劑中添加鹽酸左旋咪唑的問題鮮有報道，我院也是首次在林可霉素注射液中檢出鹽酸左旋咪唑，林可霉素與此抑菌藥配伍后，可以顯著增強其藥用效果。但添加的劑量無法控制，超量易導致動物死亡[12-14]。

3.2 檢測波長的選擇 將二極管陣列檢測器記錄的鹽酸左旋咪唑的3D色譜圖放大，可以看到在230 nm處左旋咪唑的峰強度最強，響應值最大，且無干擾，所以在230 nm通道監測和記錄。

3.3 方法評價 鹽酸林可霉素注射液在與鹽酸左旋咪唑對照品相同的保留時間處無色譜峰出現，說明林可霉素對鹽酸左旋咪唑的檢查無干擾，即本檢查法適用于鹽酸林可霉素注射液。與傳統的容量分析法和氣相、液質等方法相比，高效液相法具有方便迅速、靈敏度高、線性關系良好、精密度高的優點，是國內外普遍使用的方法[15-17]。由于林可霉素注射液的基質效應弱，緩沖鹽的洗脫能力好，可以達到較高的回收率(99.7%)，有利于對非法添加物質進行定量分析。在實際監測過程中，結合現有的篩查標準還可以實現多組份同時篩查添加物質，省時省力。

建立了高效液相色譜法測定鹽酸林可霉素注射液中非法添加鹽酸左旋咪唑的檢查方法。試驗結果表明，本方法專屬性、精密度、線性、回收率試驗均符合《中國獸藥典2015年版一部》[18]的要求，能有效檢測鹽酸林可霉素注射液中是否添加鹽酸左旋咪唑及添加量。